De voorbereiding van Aplysia Sensory-motor Neuronale Cell Cultures
Summary
Primaire culturen van<em> Aplysia</em> Sensomotorische neuronen een model voorbereiding voor het bestuderen van synapsvorming en synaptische plasticiteit<em> In vitro</em>. Deze video toont de identificatie en microdissectie van sensorische en motorische neuronen van<em> Aplysia</em> Ganglia evenals de methoden voor het opzetten en onderhouden van sensomotorische neuronen in cultuur.
Abstract
Het zenuwstelsel van de mariene weekdier Aplysia californica is relatief eenvoudig, bestaande uit ongeveer 20.000 neuronen. De neuronen zijn groot (tot 1 mm in diameter) en identificeerbaar, met verschillende maten, vormen, posities en pigmentaties, en de cellichamen worden extern blootgesteld in vijf gepaarde ganglia verspreid door het hele lichaam van het dier. Deze eigenschappen hebben toegestaan onderzoekers om de circuits onderliggende specifieke gedragingen in het dier een af te bakenen. De monosynaptic verbinding tussen sensorische en motorische neuronen is een centraal onderdeel van de kieuw-terugtrekking reflex in het dier, een eenvoudige defensieve reflex, waarin het dier zijn kieuw terugtrekt in reactie op tactiele stimulatie van de sifon. Deze reflex ondergaat vormen van non-associatief en associatief leren, met inbegrip van sensibilisering, habituatie en klassieke conditionering. Van bijzonder voordeel voor de studie van de synaptische plasticiteit, kan de sensomotorische synaps worden gereconstitueerd in cultuur, waar de goed gekarakteriseerde stimuli ontlokken vormen van plasticiteit die direct samenhangt met het gedrag van het dier 2,3 te hebben. In het bijzonder, de toepassing van serotonine produceert een synaptische versterking die, afhankelijk van de toepassing protocol, duurt minuten (op korte termijn faciliteren), uren (tussen-termijn facilitatie) of dag (op lange termijn faciliteren). In tegenstelling tot de toepassing van de peptide zender FMRFamide produceert een synaptische verzwakking of depressie die, afhankelijk van de toepassing protocol, kan duren van minuut tot dag (op lange termijn depressie). De grote omvang van de neuronen kunnen voor herhaalde scherpe elektrode opname van synaptische kracht over periodes van dagen, samen met micro-injectie van expressievectoren, siRNA's en andere verbindingen voor specifieke signaleringscascades en moleculen richten en daarmee de moleculaire en celbiologische stappen die de veranderingen ten grondslag liggen in synaptische werkzaamheid.
Een bijkomend voordeel van de Aplysia cultuur systeem komt uit het feit dat de neuronen synaps-specificiteit te tonen in de cultuur 4,5. Dus, doe sensorische neuronen vormen geen synapsen met zichzelf (autapses) of met andere sensorische neuronen, noch hebben ze synapsen vormen met non-target-geïdentificeerde motorische neuronen in cultuur. De varicosities, sites van synaptische contact tussen de zintuiglijke en motorische neuronen, zijn groot genoeg (2-7 micron in diameter), zodat synapsvorming (evenals veranderingen in de synaptische morfologie), met een doelgroep van motorische neuronen te bestuderen in het licht microscopisch niveau.
In deze video laten we zien elke stap van de voorbereiding sensomotorische neuron culturen, waaronder verlamming volwassen en jeugdige Aplysia, ontleden hun ganglia, protease vertering van het ganglia, de verwijdering van het bindweefsel door microdissectie, de identificatie van zowel de sensorische en motorische neuronen en verwijdering van elk celtype door microdissectie, aan beplating van de motor neuron, toevoeging van de sensorische neuron en manipulatie van de zintuiglijke neurieten formulier contact met de beschaafde motor neuron.
Protocol
Discussion
Het welslagen van de voorbereiding van de Aplysia sensomotorische culturen heeft een wat trage leercurve, omdat het gaat om de ontwikkeling van de fijne motoriek in verband met microdissectie en manipulatie van individuele neuronen gezien door een stereo-microscoop. In onze ervaring, duurt het ongeveer 1-3 weken van de praktijk aan gezonde geïsoleerd sensorische neuronen in cultuur en een extra 1-3 weken krijgen om te leren hoe sensorische neuronen koppelen met motorische neuronen. We routinematig bereiden cul…
Acknowledgements
Werken in het lab met betrekking tot het kweken van Aplysia neuronen wordt gefinancierd door de lijst NIH R01 en NIH R21MH077921.
Materials
Solutions needed for culture
- 0.35 M MgCl2, stored at room temperature, used for anesthesia.
- Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw.
- L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter
Add ddH20 to 1 liter. The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 µm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month.L-15 powder 13.8g NaCl 15.4 g D-Glucose 6.24 g MgSO4•7H20 6.45g KCl 350 mg NaHCO3 170 mg MgCl2•6H2O 5.49 g CaCl2•2H2O 1.43g HEPES 3.53g - Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 µm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001).
- Culture medium. Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made.
- Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl2(6H2O), 20 mM MgSO4, 10 mM CaCl2(2H2O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.
Riferimenti
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Rayport, S. G., Schacher, S. Synaptic plasticity in vitro: cell culture of identified Aplysia neurons mediating short-term habituation and sensitization. J Neurosci. 6 (3), 759-763 (1986).
- Goldberg, D. J., Schacher, S., Banker, G., Goslin, K. . Culturing Nerve Cells. , 213-236 (1998).
- Glanzman, D. L., Kandel, E. R., Schacher, S. Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of aplysia sensory neurons in vitro. Neuron. 3 (4), 441-450 (1989).
- Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49 (3), 349-356 (2006).
- Martin, K. C., Casadio, A., Zhu, H. Synapse-specific, long-term facilitation of aplysia sensory to motor synapses: a function for local protein synthesis in memory storage. Cell. 91 (7), 927-938 (1997).
- Guan, Z., Giustetto, M., Lomvardas, S. Integration of long-term-memory-related synaptic plasticity involves bidirectional regulation of gene expression and chromatin structure. Cell. 111 (4), 483-493 (2002).
