Primäre Kulturen von<em> Aplysia</em> Senso-motorischen Neuronen ein Modell Vorbereitung auf das Studium Synapsenbildung und synaptische Plastizität<em> In-vitro-</em>. Dieses Video zeigt die Identifikation und Mikrodissektion der sensorischen und motorischen Neuronen aus<em> Aplysia</em> Ganglien sowie die Methoden zur Festlegung und Aufrechterhaltung senso-motorischen Neuronen in Kultur.
Das Nervensystem der Meeresschnecke Aplysia californica ist relativ einfach, bestehend aus etwa 20.000 Neuronen. Die Neuronen sind groß (bis zu 1 mm im Durchmesser) und identifizierbar sind, mit unterschiedlichen Größen, Formen, Positionen und Pigmentierungen, und die Zellkörper nach außen in fünf gepaart Ganglien im ganzen Körper des Tieres verteilt ausgesetzt. Diese Eigenschaften haben die Forscher um die Schaltung zugrunde liegenden spezifischen Verhaltensweisen in der Tier 1 abzugrenzen erlaubt. Die monosynaptische Verbindung zwischen sensorischen und motorischen Neuronen ist ein zentraler Bestandteil der Kiemenrückziehreflex in das Tier, eine einfache Abwehrreflex in dem das Tier zieht ihren Kiemen in Reaktion auf taktile Stimulation des Siphons. Dieser Reflex erfährt Formen des nicht-assoziativen und assoziativen Lernens, einschließlich der Sensibilisierung, Gewöhnung und klassische Konditionierung. Von besonderem Nutzen für das Studium der synaptischen Plastizität kann der sensorisch-motorischen Synapse in der Kultur wieder hergestellt werden, wo gut charakterisierten Reize zu entlocken Formen der Plastizität, die direkt korreliert in das Verhalten des Tieres 2,3 haben. Speziell erzeugt Anwendung von Serotonin eine synaptische Verstärkung, dass, abhängig von der Anwendung Protokoll, dauert Minuten (kurzfristige Erleichterung), Stunden (mittelfristige Erleichterung) oder Tagen (langfristige Erleichterung). Im Gegensatz dazu erzeugt die Anwendung der Peptid-Sender FMRFamid eine synaptische Schwächung oder Depression, die, abhängig von der Anwendung Protokoll von Minuten bis Tage (long-term depression) dauern kann. Die Größe der Neuronen ermöglicht wiederholte scharfe Elektrode Aufnahme der synaptischen Erregung über Zeiträume von Tagen zusammen mit Mikroinjektion von Expressionsvektoren, siRNAs und andere Verbindungen auf spezifische Signalwege und Moleküle Ziel und damit die molekularen und zellbiologischen Schritte, die Änderungen unterliegen in der synaptischen Effizienz.
Ein weiterer Vorteil der Aplysia Kultur-System kommt von der Tatsache, dass die Neuronen Synapsen-Spezifität zeigen, in der Kultur 4,5. So müssen sensorischen Neuronen nicht bilden Synapsen mit sich selbst (autapses) oder mit anderen sensorischen Neuronen, noch bilden sie Synapsen mit Nicht-Zielorganismen identifiziert Motoneuronen in der Kultur. Die Krampfadern, Stätten der synaptischen Kontakte zwischen sensorischen und motorischen Neuronen, sind groß genug (2-7 Mikrometer im Durchmesser), damit Synapsenbildung (sowie Veränderungen der synaptischen Morphologie) mit Ziel-Motoneuronen auf das Licht mikroskopischer Ebene untersucht werden.
In diesem Video zeigen wir jeden Schritt der Herstellung sensorisch-motorischen Neurons Kulturen, einschließlich Anästhesie erwachsenen und jugendlichen Aplysia, sezieren ihre Ganglien, Proteaseverdau der Ganglien, die Entfernung des Bindegewebes durch Mikrodissektion, Identifizierung der beiden sensorischen und motorischen Neuronen und Entfernung jeder Zelltyp durch Mikrodissektion, dem Plattieren der Motoneuronen, neben der sensorischen Neuronen und Manipulation der sensorischen Neuriten Kontakt mit dem kultivierten Motoneuronen bilden.
Die erfolgreiche Herstellung von Aplysia sensomotorische Kulturen hat eine etwas langsame Lernkurve, da es die Entwicklung der Feinmotorik mit Mikrodissektion und Manipulation einzelner Nervenzellen über ein Stereo-Mikroskop betrachtet verbundenen beinhaltet. Nach unserer Erfahrung dauert es ca. 1-3 Wochen Praxis zu gesunden isolierten sensorischen Neuronen in Kultur und eine zusätzliche 1-3 Wochen erhalten zu lernen, wie sensorische Neuronen mit motorischen Neuronen Paar. Wir routinemäßig vorzubereiten Kul…
Die Arbeit im Labor mit der Kultivierung von Aplysia ist nach Liste NIH R01 und NIH R21MH077921 finanziert.
Solutions needed for culture
L-15 powder | 13.8g |
NaCl | 15.4 g |
D-Glucose | 6.24 g |
MgSO47H20 | 6.45g |
KCl | 350 mg |
NaHCO3 | 170 mg |
MgCl26H2O | 5.49 g |
CaCl22H2O | 1.43g |
HEPES | 3.53g |