変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素PAGE）

Summary

変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、一本鎖DNAを分離または500ヌクレオチドの上限に達した時点でRNAに使用されます。熱変性サンプルと非構造化一本鎖との組み合わせで尿素は、その分子量に応じてゲルマトリックス内に移行する。

Abstract

尿素PAGEまたは変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、二次的DNAまたはRNAの構造を変性し、分子量に基づいて、ポリアクリルアミドゲルマトリックス中のそれらの分離に使用される6月8日Mの尿素を、採用しています。 2から500塩基間のフラグメントは、単一のヌクレオチドのような小さな長さの違いが、この方法^1を用いて分離することができます。サンプルの移行は、選択されたアクリルアミドの濃度に依存する。ポリアクリルアミドの割合は低分子量のフラグメントを解消します。ゲルの実行中に尿素や45〜55 ° Cの温度の組み合わせは、非構造化DNAまたはRNA分子を分離することができます。

一般的にはこの方法は、一本鎖DNAまたはRNAの断片を、酵素的切断反応から次のような合成または標識オリゴヌクレオチドまたは製品を分析したり、精製するために必要です。

このビデオの記事では、変性尿素ポリアクリルアミドゲルを準備して実行する方法を示します。技術的なヒントは、元のプロトコルの^1,2に加えて、含まれています。

Protocol

この実験的な手順のための完全かつ詳細なテキストプロトコルは、分子生物学におけるカレントプロトコールで使用可能です。ゲルサンドイッチの組み立てのため、ゲルの装置のための詳細なステップバイステップの手順はBioRad社のウェブサイト³に見つけることができます。

必要な機器：
ガラス板（内側と外側）
10cmのセル：10.1 × 7.3センチメートル（インナープレート）、10.1 × 8.2センチメートル（外板）、バイオラッド
20cmのセル：20 × 20センチ（内側のプレート）、20 × 22.3センチメートル（外側のプレート）、バイオラッド
0.5〜1.5ミリメートルゲルのコームとスペーサー
ゲルキャスティングスタンド
蓋とケーブルを含むゲル装置
高電圧電源
ヒーティングブロックまたは水浴
血清学的ピペットとピペットエイド
ピペットとピペットチップ
ゲルの乾燥機やスキャナ

試薬およびソリューション：
尿素（超高純度）
40％アクリルアミド溶液（29:1）
10 × TBE溶液（トリス - ホウ酸、EDTAバッファー）
脱イオン、蒸留水
TEMED
30％（w / v）の過硫酸アンモニウム溶液
0.5 × TBEのソリューション
ホルムアミド
EDTA
キシレンシアノール
ブロモフェノールブルー
メタノール
エタノール

ボリューム	50ミリリットル			60ミリリットル			10ミリリットル
アクリルアミド濃度	10パーセント	12.5パーセント	15パーセント	10パーセント	12.5パーセント	15パーセント	10パーセント	12.5パーセント	15パーセント
グラム尿素	24	24	24	28.8	28.8	28.8	4.8	4.8	4.8
ミリリットル40パーセントアクリル（29:1）	12.5	15.625	18.75	15	18.75	22.5	2.5	3.125	3.75
UL 30％APS	166	166	166	199.2	199.2	199.2	33	33	33
UL TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 × TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
脱イオン、蒸留水でボリュームをいっぱいに

表1：一本鎖オリゴヌクレオチドを​​解決するための様々なアクリルアミド濃度とボリュームに必要な試薬およびソリューション

ゲルサンドイッチアセンブリとゲルの準備

1. メーカーの説明にしたがってゲルを組み立て、ゲルキャスティング室³にゲルを固定してください。 0.5〜1.5ミリメートル厚のスペーサーを使用してください。
2. 分子生物学における現在のプロトコールにしたがって適切なポリアクリルアミド溶液を調製するか、表1に示します。 20センチメートル× 22センチ× 1.5ミリメートル、ゲル溶液の60mlの変性アクリルアミドゲル用と10.1 × 8.2センチメートル× 1 mmのゲル5 mlのゲル溶液が十分であるために。大きなゲルは、予想される製品/バンドは数個の塩基の範囲内にある場合、その後長くゲルは、一塩基の違いでバンドを解決するために使用されます。期待されるバンドが10以上のヌクレオチドが異なる場合、小さいゲルは、フラグメントを解消するために適したものとなる。あなたの分離要件に合ったポリアクリルアミドの割合を選択して、より高いポリアクリルアミドの濃度は、低分子量のフラグメントを解決します。アクリルアミドの希望する量の超純尿素と混合して使用してください。 0.5〜1 × TBEの最終濃度を取得し、脱イオン、蒸留水でボリュームを埋めるためにゲルのミックスにTBEバッファーを追加します。電子レンジで20秒のためのソリューションを熱し、軽く混ぜる。ソリューションが手に暖機するまで大きいゲルのボリュームに対してこの手順を繰り返します。
3. すぐに血清用ピペット及び2枚のガラス板との間の自動ピペットエイドを使用してゲルを注ぐ。気泡を導入することは避けてください。コー​​ムを挿入し、ゲルが30〜60分間重合させる。

電気泳動装置をセットアップし、ゲルをプレラン

1. 指示^3を製造するためによると鋳造室や組立それからゲル装置にゲルをマウント解除します。
2. ガラス板がサブになるとバッファ（0.5〜1 × TBE）を実行して下側のバッファ室のウィットを埋めるバッファを2〜3 cmを合併。バッファを実行するとゲルの上部に上部バッファー槽がいっぱいに。
3. 慎重にコームを抜き取るとヒントをロードするピペットとゲルを使用して、実行中のバッファをウェルの中にすすいでください。
4. 高電圧電源へのケーブルのゲルシステムとプラグの蓋を取り付けます。あなたのサンプルをロードする前に、ゲルを加熱するとゲルから、残りの尿素を除去するために少なくとも30分間ゲルをプレランする必要があります。最適温度は45から55の間でなければなりません℃の温度が60 ° Cのバンドがスメアまたはガラス板が割れることができる可能性があるため。を避けるプレラン（ゲルあたり15〜25 W）のための一定の電力を選択してください。

サンプルの準備

1. その間にあなたのサンプルを準備する。したがって、あなたのサンプルに2 ×ゲルローディングミックスの適切な量を追加します。ローディングミックスは、通常、90％ホルムアミド、0.5％EDTA、0.1％キシレンシアノール、0.1％ブロモフェノールブルーが含まれています。
2. サンプルがゲル上にロードする前に、サンプルが数分間70から90 ° Cの間で試料を加熱することによって熱が変性でなければなりません。

ゲルをロードして実行

1. プレランが終了したら、蓋を取り外し、尿素が井戸に溶出したとして前に説明したように徹底的にポケットをすすいでください。
2. ポケットの底部から注意深くサンプルを適用します。気泡を導入することは避けてください。ローディングバッファーには、実行中に同じ条件を維持するために空のポケットに適用する必要があります。
3. 蓋を組み立て、55のゲルの温度を維持するために一定の電力でゲルを実行° Cプレランに似て。色素フロントがゲルの下端に達するまでのマーカー色素の移行を観察。実行期間は、使用されるアクリルアミドの割合、バッファーとゲルの厚さのイオン強度に依存しています。ランは、2〜4時間の間に続くことができます。
   ゲルの温度を確認してください。ゲルの温度計は、実行時に右の温度を監視することができます。

ゲルを処理

1. 色素フロントがゲルの終わりに達したときに下側のバッファ室からゲルを出す。チャンバーからゲルを外し、クランプを緩めます。スペーサーを離れて引いて、慎重にガラス板を解体。必要な場合は上限も含むゲル部分を切り取る。
2. 注意深くゲル固定液（TBEプラス5〜10％のメタノールとエタノールの同じ濃度）で皿にゲルを移す。 5〜10分間溶液中にゲルをそのままにしてバッファを二度変更。
3. ゲルは真空ゲル乾燥機やゲルの直接スキャンを使用してさらに処理するための準備ができています。

Discussion

1. バンドの鋭さは、いくつかの要因によって異なります。シャープなバンドのためにロードされたサンプルの量は、すなわち理想的には1から5μlの間、可能な限り小さくする必要があります。しかし、最大15μlをまだ受諾可能な解像度を確実にするロードすることができます。シャープなバンドの少ないサンプル量の結果。
2. バンドの質も、ゲルの厚さに依存しています。たとえば0.75 mmの薄いゲルは、厚さ1.5mmのゲルよりも良い結果を示す。
3. サンプルがゲルのポケットに等しく適用されていない場合は、バンドの形状はまた、ゲルローディング中に影響を及ぼすことができる。ローディングバッファーで10％グリセロールを含むこともより容易にゲルローディングとサンプルのシンク時に役立ちます。
4. 予想される製品（s）がロードする染料のいずれかと同じレベルで実行される場合、サンプルローディングバッファーに接続されている別の潜在的な問題は、発生する可能性があります。さらに、蛍光標識が使用されている場合、一部の色素は同じような波長で蛍光シグナルを示す。このパラメータが1の場合染料またはすべての染料を除去する場合は、この問題を解決することができます。それは大きさの標準として、空のウェル中に色素を含有するサンプルを実行することをお勧めします。
5. サンプルがスムーズにゲルのフロントに入ると、それは高電圧のためにそのゲルのポケットの崩壊を避けるように、実行の開始時に低電圧でも、シャープなバンドを得るのに役立ちます。ゲル（4％）スタッキング短い割合が低いのアクリルアミドは、同じバンドシャープ効果を持つことができます。
6. よく遭遇する問題は、ゲル電気泳動中にゲルを介して不均一な熱分布によるである、"笑顔"です。ゲルは、ゲルのシステムが採用される応じて、バッファに囲まれていない場合は、ガラス板に金属板を取り付けると等しい熱の分布をサポートしており、実質的にゲルの品質を向上させることができます。
7. それは非常に実行後のゲルの処理を向上するため、ゲルはガラス板に固執する傾向があるので大きいゲルのガラス板のシランは、、お勧めします。

変性尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素- PAGE）は、一本鎖DNAまたはRNA断片だけでなく、放射性ヌクレオチド、または蛍光標識サンプルを分析したり、分離すると便利です。