In vivo-like organotypiques Culture Wholemount murin rétiniennes

Summary

Cet article vidéo démontre la mise en place de cultures organotypiques rétine wholemount et une procédure d'analyse des cytospin effets induits de manière exogène. Organotypiques rétine cultures wholemount imiter la<em> In vivo</em> La situation et faciliter considérablement l'accessibilité des rétines de souris pour les manipulations expérimentales en contournant les inconvénients de modèles animaux murins classiques.

Abstract

Ablations ciblées de gènes et l'analyse des modèles animaux est la stratégie classique pour s'inscrire fonction spécifique du gène de la rétine. Toutefois, transgéniques, la rétine spécifiques ou conditionnelle des modèles de souris KO présentent souvent létalité précoce ou qui souffrent de malformations graves, empêchant une analyse au-delà embryonnaire ou postnatale premiers stades.

Culture de cellules primaires est une alternative à étudier les effets de facteurs exogènes appliqués recombinante, la surexpression de gènes ou de siRNA inactivation génique à médiation dans un environnement contrôlé. Culture de cellules dissociées a l'avantage que les signaux endogènes atteindre les cellules cibles sont réduites, facilitant ainsi l'identification des effets exogènes déclenché après la manipulation pharmacologique. Toutefois, d'importantes interactions entre cellules sont initialement détruits par la digestion enzymatique ou de dissociation mécanique, même si réagrégées cultures retinospheroid ¹ sont utilisées.

En revanche, les cultures organotypiques rétine wholemount fournir un système proche de la situation di vivo physiologiques avec des interactions neuronales et de connexions ^2-5 encore préservée.

Dans cet article nous proposons une vidéo démonstration étape par étape (1) de l'établissement d'in vivo-rétinienne, comme organotypiques cultures wholemount notamment particularités dissection de l'embryon, postnatale et adulte yeux murin et (2) une procédure de dissociation et cytospin pour l'analyse des neurones l'apoptose et la prolifération des cellules rétiniennes chez échantillons entiers organotypiques, par exemple après la culture, en présence de facteurs exogène appliquée recombinantes.

Protocol

Tout le matériel et les réactifs doivent être achetés stérile ou doit être la chaleur ou stérilisé à la vapeur ou stérilisé avec de l'EtOH 70%. Les auteurs indiquent que les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les Communautés européennes la directive du Conseil (86/609/CEE), suivant les directives du NIH concernant les soins et l'utilisation d'animaux pour des procédures expérimentales et les règlements énoncés par le comité i…

Discussion

L'avantage de ^2-5 murin organotypiques rétine cultures wholemount plus de dissociation, monocouche, retinospheroid ou ré-agrégées 3D cultures sphéroïde ¹ réside dans la préservation des interactions neuronales et de connexions, imitant la situation in vivo. En comparaison avec les anciens rapports ^2, notre article vidéo fournit une démonstration détaillée des particularités de l'énucléation des yeux murin et la dissection des rétines de différen…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Mice	Animal	Charles Rivers Laboratories
Dissection microscope	Tool	ZEISS
PBS	Reagent	Sigma		PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham	Reagent	Sigma	D 8900	DMEM / F-12
Apo-transferin	Reagent	Sigma	T 1147
Putrescin	Reagent	Sigma	P 5780
Sodium selenite	Reagent	Sigma	S 9133
Progesterone	Reagent	Sigma	P 6149
Gentamicine	Reagent	Invitrogen
L-Glutamine	Reagent	Invitrogen	25030-024	200 mM (100X), liquid
Bovine serum albumine (BSA)	Reagent	Roth	8076.3	30 mg/ml
Collagenase	Reagent	Sigma	C 0773	200 U/ml
Trypsin	Reagent	Sigma	T4799	From porcine pancreas; 1 mg/ml
Hyaluronidase	Reagent	Sigma	H 3884	200 mg/ml
DNase I	Reagent	Roche	1 284 932	10 mg/ml
EDTA	Reagent	Sigma	E 6511
Silicone solution	Reagent	Serva	35130
Paraformaldehyde (PFA)	Reagent	Sigma	P6148	8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).
4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Reagent	Sigma	D 0542	DAPI
Fluorescent Mounting Medium	Reagent	Dako	S3023
BrDU	Reagent	Sigma	B 9285
96-well plates	Tool	FALCON	3072
24-well plates	Tool	FALCON	3047
Pasteur pipettes	Tool	Brand	747720
Forceps DUMONT #5	Tool	Fine Science Tools	11252-30	bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7	Tool	Fine Science Tools	11271-30	curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors,straight, 8cm	Tool	Fine Science Tools	15000-00	fine, small straight blades
Standard scissors, straight, sharp/blunt	Tool	Fine Science Tools	14007-14	Use for decapitation or cervical dislocation
Eppendorf tubes	Tool	Eppendorf		2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin
Cooling centrifuge	Tool	Eppendorf
Rotation shaker	Tool	CAT
Cytospin	Tool	Thermo Scientific