In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina
Summary
Este artigo vídeo demonstra o estabelecimento de culturas de retina organotípicas wholemount e um procedimento para análise de cytospin exogenamente efeitos induzidos. Organotípicas retina culturas wholemount imitar o<em> In vivo</em> Situação e facilitar consideravelmente a acessibilidade dos retinas murino para manipulações experimentais, contornando as desvantagens de clássicos modelos animais murino.
Abstract
Ablações alvo de genes e análise de modelos animais é a estratégia clássica para se matricular a função do gene específico da retina. No entanto, transgênicos, modelos de mouse retina específicos ou condicional knockout freqüentemente exibem letalidade precoce ou sofrem de malformações graves, impedindo uma análise para além embrionárias ou início de estágios pós-natal.
Cultura de células primárias é uma alternativa para investigar os efeitos da aplicação exógena fatores recombinantes, superexpressão de genes ou siRNA mediada knockdown do gene em um ambiente controlado. Cultura de células dissociadas tem a vantagem de que os sinais endógenos atingindo as células-alvo são reduzidos, facilitando assim a identificação de exogenamente efeitos desencadeados após manipulação farmacológica. No entanto, importantes interações célula-célula são inicialmente destruída por digestão enzimática ou dissociação mecânica, mesmo se re-agregados culturas retinospheroid 1 são utilizados.
Pelo contrário, organotípicas retina culturas wholemount fornecer um sistema próximo ao fisiológico situação di vivo com as interações e conexões neuronais 2-5 ainda preservada.
Neste artigo apresentamos uma video passo a passo de demonstração (1) o estabelecimento de in vivo da retina-como organotípicas culturas wholemount incluindo peculiaridades dissecção da embrionárias, pós-natal e adulto olhos murino e (2) um procedimento de dissociação e cytospin para análise de neuronal apoptose e proliferação das células da retina em wholemounts organotípicas, por exemplo, após a cultura na presença de fatores aplicada exogenamente recombinante.
Protocol
Discussion
A vantagem de 2-5 murino organotípicas culturas de retina wholemount mais de dissociação, monocamada, retinospheroid ou re-agregados 3D culturas esferóide 1 encontra-se na preservação de interações e conexões neuronais, simulando a situação in vivo. Em comparação com os relatórios anteriores 2, o nosso artigo de vídeo oferece uma demonstração detalhada das peculiaridades em enucleação dos olhos murino e dissecção de retinas de diferentes estágios d…
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a E. de la Rosa e AI Valenciano para ajuda inicial com o estabelecimento das culturas organotípicas e U. Laub e U. Gerster para assistência técnica.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
Riferimenti
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
