Organotipik murin Retina Wholemount Kültür in vivo
Summary
Bu video makale Organotipik retina wholemount kültürler ve eksojen kaynaklı etkileri analizi için bir sitospin prosedürü kurulması göstermektedir. Organotipik retina wholemount kültürleri taklit<em> In vivo</em> Durum ve klasik fare hayvan modellerinde dezavantajları engellemeyi deneysel manipülasyonlar için fare retina erişilebilirliğini önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.
Abstract
Genler ve hayvan modellerinde analiz Hedeflenen ablasyonların kayıt yaptıran özel retina gen fonksiyonu için klasik bir strateji. Ancak, transgenik, retina özel veya koşullu nakavt fare modelleri genellikle erken öldürücülüğü görüntülemek veya embriyonik ya da erken doğum sonrası aşamalarında ötesinde bir analiz önlemede ciddi malformasyonlar muzdarip.
Primer hücre kültürü Eksojen olarak uygulanan rekombinant faktörler, gen ya da kontrollü bir ortamda siRNA-aracılı gen demonte aşırı ekspresyonu etkilerini araştırmak için bir alternatiftir. Disosiye hücre kültürü, böylece, farmakolojik manipülasyon sonra eksojen tetiklenen etkileri kimlik kolaylaştırmak, hedef hücreleri ulaşan endojen sinyalleri azalır avantajı vardır. Ancak, önemli hücre-hücre etkileşimleri başlangıçta yeniden toplanan retinospheroid kültürler 1 kullanılsa bile, enzimatik sindirim veya mekanik ayrılma tarafından yok edilir.
Buna karşılık, Organotipik retina wholemount kültürler nöronal etkileşimleri ve bağlantıları hala korunmuş 2-5 in vivo durum fizyolojik yakın bir sistem sağlar .
Bu video makalede, postnatal embriyonik ve yetişkin fare gözleri diseksiyonu özellikleri ve nöronal analizi (2) bölünmeler ve sitospin prosedürü de dahil olmak üzere Organotipik retina wholemount kültür gibi in vivo (1) kurulmasına adım gösteri bir adım Eksojen olarak uygulanan rekombinant faktörleri varlığında kültür sonra apoptoz ve Organotipik wholemounts retinal hücre çoğalması, örn.
Protocol
Discussion
Disosiasyon, tek tabaka üzerinde fare Organotipik retina wholemount kültürleri 2-5, retinospheroid veya yeniden toplanan 3D sfero kültürlerin korunması nöronal etkileşimleri ve bağlantıları 1 yalan, avantaj in vivo durumu taklit. Eski raporlar 2 karşılaştırıldığında, video makalede, lens ve vitreus retina zarar vermeden kaldırılması da dahil olmak üzere farklı gelişim evreleri retina fare gözleri ve diseksiyon enükleasyon özellikleri ayrıntılı bir …
Acknowledgements
Yazarları, teknik yardım için Organotipik kültürleri ve U. Laub ve U. Gerster kuruluşu ile E. de la Rosa ve AI Valenciano ilk yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
Riferimenti
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
