In vivo-ähnlichen Organotypische Murine Retinal Wholemount Kultur
Summary
Dieses Video Artikel veranschaulicht die Einrichtung von organotypischen Retina wholemount Kulturen und einer Cytospin Verfahren zur Analyse von exogen induzierten Effekte. Organotypischen Retina wholemount Kulturen imitieren die<em> In vivo</em> Situation und deutlich erleichtern die Zugänglichkeit von murinen Retina für experimentelle Manipulationen unter Umgehung der Nachteile der klassischen Maus-Tiermodell.
Abstract
Gezielte Ablationen von Genen und Analyse von Tiermodellen ist die klassische Strategie für die Einschreibung spezifische retinale Genfunktion. Allerdings transgenen, Retina-spezifische oder Knockout-Mausmodelle zeigen oft schon Letalität oder an einer schweren Fehlbildungen, verhindern eine Analyse über die embryonalen oder frühen postnatalen Stadien.
Primäre Zellkultur ist eine Alternative zu den Auswirkungen der exogen applizierten rekombinanten Faktoren, die Überexpression von Genen oder siRNA-vermittelten Gen-Knockdown in einer kontrollierten Umgebung zu untersuchen. Dissoziierten Zellkultur hat den Vorteil, dass das körpereigene Signale erreichen die Zielzellen reduziert werden, wodurch auch die Identifikation von exogen ausgelöst Wirkungen nach pharmakologischen Manipulation. Allerdings sind wichtige Zell-Zell-Interaktionen zunächst durch enzymatische Verdauung oder mechanische Dissoziation zerstört, auch wenn re-aggregiert retinospheroid Kulturen 1 verwendet werden.
Im Gegensatz dazu bieten organotypischen Retina wholemount Kulturen ein System in der Nähe der physiologischen in vivo Situation mit neuronalen Interaktionen und Verbindungen noch erhaltenen 2-5.
In diesem Video-Artikel bieten wir Ihnen eine Schritt für Schritt Demonstration (1) die Einrichtung von in vivo-ähnlichen organotypischen Retina wholemount Kulturen einschließlich Dissektion Besonderheiten der embryonalen, postnatalen und adulten murinen Augen und (2) eine Dissoziation und Zytospin Verfahren zur Analyse von neuronalen Apoptose und retinalen Zell-Proliferation in organotypischen wholemounts nach Kultur in Gegenwart von exogen applizierten rekombinanten Faktoren wie zB.
Protocol
Discussion
Der Vorteil der murine organotypischen Retina wholemount Kulturen 2-5 über Dissoziation, Monolayer, retinospheroid oder re-aggregiert 3D Sphäroid Kulturen 1 liegt in der Erhaltung der neuronalen Interaktionen und Verbindungen, imitiert die in vivo Situation. Im Vergleich zu früheren Berichten 2, bietet unser Video Artikel eine ausführliche Demonstration der Besonderheiten in Enukleation murine Augen und Dissektion der Netzhaut von verschiedenen Entwicklungsstadien einschlie?…
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei E. de la Rosa und AI Valenciano für erste Hilfe zu danken mit der Gründung der organotypischen Kulturen und U. Laub und U. Gerster für die technische Unterstützung.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
Riferimenti
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
