In vivo-liknande Organotypic Murine Retinal Wholemount Kultur
Summary
Denna video artikeln visar inrättandet av organotypic retinal wholemount kulturer och en cytospin förfarande för analys av exogent inducerade effekter. Organotypic näthinnan wholemount kulturer härma<em> In vivo</em> Situation och avsevärt underlätta tillgängligheten till murina näthinnor för experimentella manipulationer samtidigt som den kringgår nackdelarna med klassiska murina djurmodeller.
Abstract
Riktade ablationer av gener och analys av djurmodeller är den klassiska strategin för inskrivning specifika retinal geners funktion. Men transgena, näthinnan-specifika eller villkorlig knockout musmodeller visar ofta tidiga dödsfall eller lider av svåra missbildningar och förhindrar en analys bortom embryonala eller tidig postnatal stadier.
Primära cellkulturer är ett alternativ att undersöka effekterna av exogent tillämpas rekombinanta faktorer, överuttryck av gener eller siRNA-medierad gen ÖVERVÄLDIGANDE i en kontrollerad miljö. Dissocierade cellodling har fördelen att den endogena signalerna når målet cellerna minskar, vilket underlättar identifieringen av exogent utlöst effekter efter farmakologisk manipulation. Dock är viktiga cell-cell interaktioner initialt förstörts genom enzymatisk spjälkning eller mekaniska dissociation, även om re-aggregerade retinospheroid kulturer 1 används.
Däremot organotypic retinala wholemount kulturer tillhandahålla ett system nära den fysiologiska in vivo-situationen med neuronala kontakter och anslutningar fortfarande bevarade 2-5.
I denna video artikeln ger vi en steg för steg demonstration av (1) upprättande av in vivo-liknande organotypic retinal wholemount kulturer inklusive dissektion egenheter av embryonala, postnatal och vuxna murina ögon och (2) en dissociation och cytospin förfarande för analys av neuronala apoptos och retinal cellproliferation i organotypic wholemounts, t.ex. efter kulturen i närvaro av exogent tillämpas rekombinanta faktorer.
Protocol
Discussion
Fördelen med murina organotypic retinal wholemount kulturer 2-5 över dissociation, monolager, retinospheroid eller återexporteras aggregerade 3D sfäroid kulturer 1 ligger i bevarandet av neuronala interaktioner och anslutningar, härma in vivo-situationen. I jämförelse med tidigare rapporter 2, ger vår video artikeln en ingående demonstration av de egenheter i enucleation av murina ögon och dissekering av näthinnor i olika utvecklingsstadier, inklusive borttagnin…
Acknowledgements
Författarna vill tacka E. de la Rosa och AI Valenciano för inledande hjälp med inrättandet av organotypic kulturer och U. Laub och U. Gerster för tekniskt stöd.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
Riferimenti
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
