Microfluidica Co-coltura di cellule epiteliali e batteri per le indagini solubile del segnale mediato da Interazioni
Summary
Questo protocollo descrive un microfluidica co-coltura modello per la cultura contemporanea e localizzato delle cellule epiteliali e batteri. Questo modello può essere utilizzato per indagare il ruolo dei diversi segnali solubili molecolare sulla patogenesi e schermo l'efficacia del putativo ceppi batterici probiotici.
Abstract
L'essere umano gastrointestinale (GI) è un ambiente unico in cui cellule epiteliali intestinali e non patogeni (commensale) batteri coesistono. E 'stato proposto che il microambiente che il patogeno incontra nello strato commensali è importante per determinare l'entità della colonizzazione. Metodi di coltura per lo studio attuale colonizzazione dei patogeni non sono adatti per indagare questa ipotesi in quanto non consentono di co-coltura di batteri e cellule epiteliali in un modo che simula il microambiente del tratto gastrointestinale. Qui descriviamo una microfluidica co-coltura modello che consente la cultura indipendente delle cellule eucariotiche e batteri, e testare l'effetto del microambiente commensale sulla colonizzazione dei patogeni. La co-coltura modello è dimostrato attraverso lo sviluppo di un commensale<em> Escherichia coli</emBiofilm> tra le cellule HeLa, seguito da introduzione di enteroemorragica<em> E. coli</em> (EHEC) nell'isola commensali, in una sequenza che riproduce la sequenza degli eventi nelle infezioni del tratto gastrointestinale.
Protocol
Discussion
Test convenzionale per attaccamento patogeno e la colonizzazione utilizzare un monostrato di cellule eucariote in piastre di coltura dei tessuti in cui vengono aggiunti gli agenti patogeni. Questi modelli non sono fisiologicamente rilevanti in quanto non contengono un commensale biofilm batterici sviluppato su cellule eucariotiche. Semplice aggiunta di un pre-cresciuta coltura batterica alle cellule eucariotiche è improbabile che possa portare a questa conformazione come biofilm sono altamente organizzate strutture che…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation (cbet 0.846.453) e il National Institutes of Health (1R01GM089999).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SU-8 2050 | Microchem Corp, MA | |||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | |||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | ||
| PDMS | Dow Corning, WI | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | ||
| DMEM | Thermo Scientific | SH30002.02 | ||
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | ||
| Mask aligner | Neutronix-Quintel, PA | Q4000 | ||
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | ||
| Syringe pump | Harvard Apparatus, MA | |||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
Riferimenti
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