MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina
Summary
Este video demuestra la preparación de un diseño ultra-delgado de matriz / analito capa para el análisis de péptidos y proteínas por láser asistida por matriz de desorción ionización espectrometría de masas (MALDI-MS).
Abstract
Este video demuestra la preparación de un diseño ultra-delgado de matriz / analito capa para el análisis de péptidos y proteínas por láser asistida por matriz de desorción ionización espectrometría de masas (MALDI-MS) 1, 2. El método de la capa de ultra-delgada con la producción de una capa de sustrato de los cristales de la matriz (alfa-ciano-4-hidroxicinámico) en la placa de la muestra, que sirve como terreno de siembra para la cristalización posterior de una mezcla de matriz / analito. Ventajas del método de la capa ultra delgada con respecto a otros métodos de deposición de la muestra (por ejemplo, las gotas secas) es que proporciona (i) una mayor tolerancia a las impurezas tales como sales y detergentes, (ii) una mejor resolución, y (iii) mayor uniformidad espacial. Este método es especialmente útil para la determinación de la masa exacta de las proteínas. El protocolo fue inicialmente desarrollado y optimizado para el análisis de las proteínas de la membrana y se utiliza para analizar con éxito los canales iónicos, transportadores de metabolitos, y los receptores, que contiene entre 2 y 12 dominios transmembrana 2. Desde la publicación original, sino que también ha demostrado ser igualmente útil para el análisis de proteínas solubles. De hecho, lo hemos usado para un gran número de proteínas con una amplia gama de propiedades, incluyendo aquellos con masas moleculares de hasta 380 kDa 3. Actualmente es nuestro método de elección para el análisis de la masa molecular de las proteínas. El procedimiento descrito consistentemente produce espectros de alta calidad, y es sensible, robusto y fácil de implementar.
Protocol
Materials
It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).
Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H2O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol
Riferimenti
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
