MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة
Summary
هذا الفيديو يوضح إعداد طبقة مصفوفة / الحليلة رقيقة جدا لتحليل الببتيدات والبروتينات التي كتبها ماتريكس بمساعدة الليزر المج التأين طيف الكتلة (MS – MALDI).
Abstract
هذا الفيديو يوضح إعداد طبقة مصفوفة / الحليلة رقيقة جدا لتحليل الببتيدات والبروتينات التي كتبها ماتريكس بمساعدة الليزر المج التأين مطياف الكتلة (MS – MALDI) 1 ، 2. الأسلوب طبقة رقيقة جدا ينطوي على إنتاج طبقة من البلورات الركيزة المصفوفة (ألفا cyano – 4 – hydroxycinnamic حامض) على لوحة عينة ، التي هي بمثابة بذر الأرض لبلورة اللاحقة من خليط المصفوفة / الحليلة. مزايا الأسلوب طبقة رقيقة جدا اكثر من غيرها من الأساليب ترسيب العينة (الحبرية المجففة مثلا) هو أنه يقدم (ط) لمزيد من التسامح الشوائب مثل الأملاح والمنظفات ، (ب) تحسين القرار ، و (ج) التوحيد أعلى المكاني. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لتحديد كتلة دقيقة من البروتينات. وقد وضعت في البداية البروتوكول والأمثل لتحليل البروتينات والأغشية المستخدمة لتحليل بنجاح القنوات الأيونية والناقلين المستقلب ، والمستقبلات ، التي تتضمن بين المجالات عبر الغشاء 2 و 12 2. منذ نشر الأصلي ، وقد أظهرت أيضا أن يكون مفيدا أيضا لتحليل البروتينات القابلة للذوبان. في الواقع ، لقد اعتدنا عليه لعدد كبير من البروتينات وجود مجموعة واسعة من الخصائص ، بما فيها تلك الجماهير الجزيئية تصل إلى 380 كيلو دالتون 3. وهو حاليا لدينا وسيلة لاختيار لتحليل الكتلة الجزيئية لجميع البروتينات. ووصف الإجراء ينتج باستمرار الأطياف عالية الجودة ، وأنها حساسة وقوية ، وسهلة التنفيذ.
Protocol
Materials
It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).
Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H2O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol
Riferimenti
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
