Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince
Summary
Cette vidéo montre la préparation d'un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Désorption Ionisation Mass Spectrometry (MALDI-MS).
Abstract
Cette vidéo montre la préparation d'un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Spectrométrie de masse par désorption ionisation (MALDI-MS) 1, 2. La méthode de la couche ultra-mince implique la production d'une couche de substrat de cristaux de matrice (alpha-cyano-4-hydroxycinnamique) sur la plaque échantillon, qui sert de terrain d'ensemencement pour la cristallisation subséquente d'un mélange matrice / analyte. Avantages de la méthode de la couche ultra-mince par rapport aux autres approches de dépôt de l'échantillon (par exemple goutte séchée) sont qu'il fournit (i) une plus grande tolérance aux impuretés telles que les sels et les détergents, (ii) une meilleure résolution, et (iii) plus l'uniformité spatiale. Cette méthode est particulièrement utile pour la détermination de la masse exacte de protéines. Le protocole a été initialement développé et optimisé pour l'analyse des protéines membranaires et utilisé avec succès pour analyser les canaux ioniques, transporteurs métabolite, et les récepteurs, contenant entre 2 et 12 domaines transmembranaires 2. Depuis la publication originale, elle a également montré pour être tout aussi utile pour l'analyse des protéines solubles. En effet, nous avons utilisé pour un grand nombre de protéines ayant une large gamme de propriétés, y compris ceux avec des masses moléculaires plus élevé que 380 kDa 3. Il est actuellement notre méthode de choix pour l'analyse de masse moléculaire de toutes les protéines. La procédure décrite produit une qualité constante des spectres, et il est sensible, robuste et facile à mettre en œuvre.
Protocol
Materials
It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).
Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H2O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol
Riferimenti
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
