MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode
Summary
Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS).
Abstract
Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS) 1, 2. Die ultra-dünne Schicht Methode umfasst die Herstellung einer Trägerschicht aus Matrix-Kristalle (alpha-Cyano-4-Hydroxy-Säure) auf die Probe Platte, die als Impfstoff Boden für nachfolgende Kristallisation aus einer Matrix / Analyt-Mischung dient. Vorteile der ultra-dünne Schicht Methode gegenüber anderen Probe Ablagerung Ansätze (z. B. getrocknete Tropfen) sind, dass es (i) sorgt für mehr Toleranz gegenüber Verunreinigungen wie Salzen und Detergenzien, (ii) eine bessere Auflösung, und (iii) eine höhere räumliche Gleichförmigkeit. Diese Methode ist besonders nützlich für die genaue Bestimmung der Masse von Proteinen. Das Protokoll wurde ursprünglich entwickelt und optimiert für die Analyse von Membranproteinen und verwendet werden, um erfolgreich zu analysieren Ionenkanälen, Transportern Metabolit, und Rezeptoren, die zwischen 2 und 12 Transmembrandomänen 2. Seit der ursprünglichen Veröffentlichung, hat sie auch gezeigt werden, gleichermaßen nützlich für die Analyse von löslichen Proteinen. In der Tat haben wir es für eine große Anzahl von Proteinen mit einer breiten Palette von Eigenschaften, einschließlich solcher mit molekularen Massen so hoch etwa 380 kDa 3 verwendet. Es ist derzeit unsere Methode der Wahl für die molekulare Masse Analyse aller Proteine. Die beschriebene Vorgehensweise konsequent produziert hochwertige Spektren, und es ist empfindlich, robust und einfach zu implementieren.
Protocol
Materials
It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).
Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H2O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol
Riferimenti
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
