Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).
Abstract
Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine da Matrix-Assisted Laser Spettrometria di Massa desorbimento ionizzazione (MALDI-MS) 1, 2. L'ultra-sottile strato metodo comporta la produzione di un substrato di cristalli di matrice (alfa-ciano-4-acido idrossicinnamici) sulla piastra del campione, che serve come terreno per la semina successiva cristallizzazione di una matrice / analita miscela. I vantaggi del metodo ultra-sottile strato rispetto ad altri approcci deposizione del campione (ad esempio delle gocce essiccate) sono che offre (i) maggiore tolleranza alle impurità come i sali e detergenti, (ii) la migliore risoluzione, e (iii) maggiore uniformità spaziale. Questo metodo è particolarmente utile per la determinazione della massa accurata delle proteine. Il protocollo è stato inizialmente sviluppato ed ottimizzato per l'analisi delle proteine di membrana e utilizzato per analizzare con successo i canali ionici, trasportatori metabolita, e recettori, contenente tra 2 e 12 domini transmembrana 2. Dopo la pubblicazione originale, ma ha anche dimostrato di essere ugualmente utile per l'analisi di proteine solubili. Anzi, lo abbiamo usato per un gran numero di proteine che hanno una vasta gamma di proprietà, compresi quelli con peso molecolare alto come 380 kDa 3. Oggi è il nostro metodo di scelta per l'analisi molecolare di massa di tutte le proteine. La procedura descritta produce costantemente spettri di alta qualità, ed è sensibile, robusto e facile da implementare.
Protocol
E 'molto importante indossare guanti privi di polvere durante la preparazione dello strato sottile. Pulizia della piastra del campione Utilizzare un acciaio inossidabile placcata in oro o campione MALDI. Lavare con MeOH e strofinare delicatamente con un Kimwipe. Non strofinare o strofinare la superficie con il Kimwipe, per evitare di graffiare la superficie. Lavare con H 2 O e strofinare delicatamente con un Kimwipe. Lavare con MeOH e strof…
Materials
It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).
Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H2O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol
Fenyo, D., Wang, Q., DeGrasse, J. A., Padovan, J. C., Cadene, M., Chait, B. T. MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method. J. Vis. Exp. (3), e192, doi:10.3791/192 (2007).