MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi
Summary
Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.
Abstract
Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) 1, 2, peptidler ve proteinler analiz etmek için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir. Ultra-ince bir tabaka yöntemi, matris kristalleri bir matris / analit karışımı sonraki kristalizasyon için ekim alanı olarak hizmet veren örnek bir tabak, bir substrat katmanı üretimi (alfa-siyano-4-hydroxycinnamic asit) içerir. Diğer örnek birikimi yaklaşımlar (örneğin kuru damlacık) üzerinden ultra-ince bir tabaka yöntemin avantajları (i), tuzları ve deterjanlar, (ii) daha iyi çözünürlük, ve (iii) yüksek uzaysal tekdüzelik gibi kirleri daha fazla dayanıklılık sağlar. Bu yöntem, proteinlerin doğru kitle belirlenmesi için özellikle yararlıdır. Bu protokol başlangıçta geliştirilmiş ve membran proteinlerin analizi için optimize edilmiş ve başarıyla iyon kanalları, metaboliti taşıyıcılar ve reseptörler analiz etmek için kullanılır, 2 ile 12 transmembran etki alanı 2 arasındaki içeren oldu. Orijinal yayınlandığından beri, aynı zamanda eşit çözünür proteinlerin analizi için yararlı olduğu gösterilmiştir. Gerçekten de, 380 kDa 3 gibi yüksek molekül kitleler de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede, özellikleri olan proteinlerin çok sayıda kullanmıştır. Şu anda tüm proteinlerinin moleküler kitle analizi için tercih edilen bir yöntemdir. Açıklanan prosedür tutarlı, yüksek kaliteli spektrumları üretir ve hassas, sağlam ve uygulanması kolay.
Protocol
Materials
It is critical that all reagents are of highest-quality (e.g. HPLC-grade).
Powder-free gloves (latex or nitrile)
Stainless steel or gold MALDI sample plate
Methanol (MeOH)
Water
Kimwipes
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (4-HCCA)
Trifluoroacetic acid (TFA) (final concentration in 0.1% in H2O)
Acetonitrile (ACN)
Formic acid
Isopropanol
Riferimenti
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
