Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66117
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Wayne State University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

פרוטוקול זה פותח כדי לנטר לאורך זמן את התכונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית במהלך נוירולציה של עובר אפרוח. הוא מבוסס על שילוב של מיקרוסקופ ברילואין ומערכת דגירה על הבמה, המאפשרת הדמיה מכנית חיה של רקמת לוחית עצבית בעוברי אפרוחים בתרבית לשעבר .

Abstract

סגירת צינור עצבי (NTC) היא תהליך קריטי במהלך ההתפתחות העוברית. כישלון בתהליך זה עלול להוביל למומים בתעלה העצבית, ולגרום למומים מולדים או אפילו לתמותה. NTC כוללת סדרה של מנגנונים ברמה גנטית, מולקולרית ומכנית. בעוד רגולציה מכנית הפכה לנושא אטרקטיבי יותר ויותר בשנים האחרונות, היא נותרה במידה רבה לא נחקרת בשל היעדר טכנולוגיה מתאימה לביצוע בדיקות מכניות של רקמות עובריות תלת ממדיות באתרן. בתגובה, פיתחנו פרוטוקול לכימות התכונות המכניות של רקמה עוברית של תרנגולת באופן לא מגע ולא פולשני. זה מושג על ידי שילוב מיקרוסקופ Brillouin קונפוקלי עם מערכת דגירה על הבמה. כדי לחקור את מכניקת הרקמות, עובר טרום תרבית נאסף ומועבר לאינקובטור על הבמה לתרבית אקס אובו . במקביל, התמונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית נרכשות על ידי מיקרוסקופ ברילואין בנקודות זמן שונות במהלך הפיתוח. פרוטוקול זה כולל תיאורים מפורטים של הכנת דגימות, יישום ניסויים במיקרוסקופ ברילואין, ונתונים לאחר עיבוד וניתוח. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לחקור את האבולוציה המכנית של רקמה עוברית במהלך ההתפתחות לאורך זמן.

Introduction

מומים בתעלה העצבית (NTDs) הם מומים מולדים חמורים של מערכת העצבים המרכזית הנגרמים על ידי כשלים בסגירת הצינור העצבי (NTC) במהלך ההתפתחות העוברית1. האטיולוגיה של NTDs מורכבת. מחקרים הראו כי NTC כרוך ברצף של תהליכים מורפוגנטיים, כולל הרחבה מתכנסת, כיפוף של הלוח העצבי (למשל, התכווצות אפית), העלאת הקפל העצבי, ולבסוף היצמדות של הקפל העצבי. תהליכים אלה מוסדרים על ידי מנגנונים מולקולריים וגנטיים מרובים 2,3, וכל תקלה בתהליכים אלה עלולה לגרום NTDs 4,5,6. ככל שהראיות המצטברות מצביעות על כך שרמזים מכניים ממלאים תפקידים מכריעים גם במהלך NTC 3,7,8,9,10,11, ונמצאו קשרים בין גנים ורמזים מכניים 12,13,14, זה הופך להיות הכרחי לחקור את הביומכניקה של הרקמה במהלך הנוירולציה.

מספר טכניקות פותחו למדידת התכונות המכניות של רקמות עובריות, כולל אבלציה בלייזר (LA)15, דיסקציה והרפיה של רקמות (TDR)16,17, שאיפת מיקרופיפטה (MA)18, ננו-הזחה19 מבוססת מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מיקרו-כניסות (MI) ומיקרו-צלחות (MP)20, מיקרו-ריאולוגיה (MR) עם פינצטה אופטית/מגנטית 21,22,23וחיישנים מבוססי טיפות24., שיטות קיימות יכולות למדוד תכונות מכניות ברזולוציות מרחביות החל מקשקשים תת-תאיים ועד קשקשים רקמתיים. עם זאת, רוב השיטות הללו הן פולשניות מכיוון שהן דורשות מגע עם הדגימה (למשל, MA, AFM, MI ו- MP), הזרקת חומר חיצוני (למשל, MR וחיישנים מבוססי טיפות), או דיסקציה של רקמות (למשל, LA ו- TDR). כתוצאה מכך, זה מאתגר עבור שיטות קיימות כדי לפקח על האבולוציה המכנית של רקמת צלחת עצבית באתרו25. לאחרונה, אלסטוגרפיה של קוהרנטיות אופטית מהדהדת הראתה הבטחה למיפוי מכני ללא מגע ברזולוציה מרחבית גבוהה26.

מיקרוסקופ ברילואין קונפוקלי הוא שיטה אופטית מתפתחת המאפשרת כימות ללא מגע של ביומכניקה של רקמות ברזולוציה תת-תאית 27,28,29,30. מיקרוסקופ ברילואין מבוסס על עקרון פיזור האור הספונטני, שהוא האינטראקציה בין אור הלייזר המאורע לבין הגל האקוסטי הנגרם על ידי תנודות תרמיות בתוך החומר. כתוצאה מכך, האור המפוזר חווה שינוי תדר, המכונה הסטת ברילואין ωR, בעקבות משוואה31:

Equation 1 (1)

כאן, Equation 2 הוא מקדם השבירה של החומר, λ הוא אורך הגל של אור האירוע, M הוא המודולוס האורכי, ρ הוא צפיפות המסה, ו-θ היא הזווית בין אור האירוע לאור המפוזר. עבור אותו סוג של חומרים ביולוגיים, היחס בין מקדם השבירה לצפיפות Equation 3 הוא קבוע בקירוב 28,32,33,34,35,36. לפיכך, ניתן להשתמש ישירות בשינוי ברילואין כדי להעריך שינויים מכניים יחסיים בתהליכים פיזיולוגיים. ההיתכנות של מיקרוסקופ ברילואין אומתה בדגימות ביולוגיות שונות 29,37,38. לאחרונה הודגמה הדמיה מכנית בהילוך מהיר של עובר אפרוח חי על ידי שילוב של מיקרוסקופ ברילואין עם מערכת דגירה על הבמה39. פרוטוקול זה מספק תיאורים מפורטים של הכנת דגימה, יישום ניסוי ועיבוד וניתוח נתונים לאחר מכן. אנו מקווים שמאמץ זה יאפשר אימוץ נרחב של טכנולוגיית ברילואין ללא מגע לחקר רגולציה ביומכנית בהתפתחות עוברים ומומים מולדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וויין סטייט.

1. הכנה ניסיונית

  1. השתמש בתמיסת אתנול 70% כדי לנקות ולעקר את המספריים והפינצטה. כמו כן, להכין פיפטות חד פעמיות מזרק.
  2. הכינו מדיום שטיפה על ידי הוספת 3.595 גרם של NaCl ל 495 מ"ל של מים נטולי יונים. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (5 U / mL) למדיום. ממלאים צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ במדיום הכביסה ומחממים אותה ל-37°C.
  3. הכינו מנות תרבות לפי איור 1, שממחיש את התצורה הכוללת.
    1. מכינים פיסת נייר פילטר, חותכים אותה לצורה מלבנית של כ-17 מ"מ ×-20 מ"מ, ומסירים את ארבע הפינות. צרו מרכז חלול בנייר הסינון, בגודל של כ-7 מ"מ ×-10 מ"מ לאבטחת העובר (איור 1, משמאל).
      הערה: אוסף העוברים מתואר בשלב 2.
    2. חבר טבעת זמינה מסחרית (Φ = 1 אינץ ', ראה טבלת חומרים) עם שכבת סרט גמישה (כלומר, סרט פרפין), כדי להבטיח שלסרט הגמיש יש גם מרכז חלול. טבעת זו עם הסרט תשמש להחזקת נייר הסינון עם העובר.
    3. לבסוף, הניחו את הטבעת המוכנה בתוך צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ (איור 1, מימין).
      הערה: נייר הסינון נועד לאבטח ולהחזיק את העובר שחולץ על ידי הנחת נייר הסינון על הממברנה והשארת העובר באזור החלול המרכזי (שיפורט בשלב 2). ארבע הפינות נחתכו כך שיתאימו לגודל הטבעת החיצונית (אין צורך אם היא כבר מותאמת). צלחת תרבית בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ משמשת להתפשטות טובה יותר של קרן לייזר. למנה יש באר פנימית (Φ = 23 מ"מ), אותה ניתן למלא באלבומן לתרבות אקס אובו . קוטר הטבעת חייב להיות גדול יותר מקוטר הבאר הפנימית כדי שניתן יהיה לכסות את הבאר על-ידי הסרט הגמיש שעל הטבעת (איור 1, כניסה). גודל נייר הסינון אינו מוגבל וניתן לשנותו בהתאם לגודל הטבעת שנבחרה וצלחת התרבית. לחלופין, ניתן לצפות מראש את תחתית המנה בשכבת אגרוז (עובי: ~1 מ"מ). על ידי הסרת אגרוז ממרכז השכבה באמצעות להב, ניתן ליצור באר בעלת צורה דומה למרכז החלול של הסרט הגמיש לטעינת אלבומן. נקודה קריטית אחת היא שארבעת הצדדים של נייר הסינון החלול צריכים להיות ברוחב מספיק (> 5 מ"מ) כדי להבטיח את החיבור של העובר.

2. מיצוי ותרבית אקס אובו של עובר התרנגולת

הערה: שלב זה שונה מדוחות40,41 שפורסמו בעבר.

  1. לאחר טרום תרבית, שלפו את הביצה מהאינקובטור והניחו אותה על צירה הארוך על מגש קרטון הביצים. נקו את קליפת הביצה עם 70% אתנול, הקפידו לכסות את כל פני השטח ולאחר מכן אפשרו לה לנוח במשך 15 דקות.
  2. מחזיקים את הביצה על צירה הקצר ומפצחים אותה בתחתית. פתחו את הביצה מעל צלחת פטרי נקייה בקוטר 100 מ"מ כדי לחלץ את תכולתה, כפי שמודגם באיור 2. הקפידו לא לסובב את הביצה בזמן שאתם מחזיקים ומפצחים אותה.
  3. בעזרת פיפטה, מעבירים ואוספים כ-10 מ"ל מהאלבומן הדק (כלומר, האלבומןהנוזלי 42) לתוך צינור של 15 מ"ל לשימוש בתרבית אקס-אובו . מלאו את הבאר המרכזית של צלחת התרבית בחלבון הדק שנאסף (כ-0.9 מ"ל), כפי שמוצג באיור 3. תהליך המילוי צריך להיות איטי, הימנעות היווצרות של כל בועות בתוך הבאר. ודא כי צלחת התרבות עם אלבומן הוא מחומם ל 37 °C (77 °F).
    הערה: מאכל זה ישמש לגידול העובר לשעבר. כלי תרבית חדשים מלאים במדיום שטיפה ישמשו במהלך הדמיה ברילואין (ראה שלב 3).
  4. בעזרת נייר טישו, הסירו בעדינות את האלבומן העבה (כלומר, האלבומן הצמיגי) המחובר לעובר על-ידי הפרדה זהירה של האלבומן מקרום הוויטליין, כפי שמודגם באיור 4. הימנע ממגע ישיר עם קרום ויטלין.
  5. לאחר הסרת כל האלבומן העבה, מדביקים בזהירות את נייר הסינון לקרום הוויטליין. ודא שציר הגוף של העובר מיושר עם הציר הארוך של המלבן המרכזי על נייר הסינון. השתמש במספריים כדי לחתוך את הקרום המקיף את נייר הסינון.
  6. בעזרת פינצטה, משכו בעדינות את נייר הסינון המבודד מהחלמון לכיוון אלכסוני. הפוך את נייר הסינון כדי למקם את העובר עם הצד הגבי שלו כלפי מטה (לתצורת מיקרוסקופ הפוך). טבלו בזהירות את כל נייר הסינון מצד אחד של הציר הארוך לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ עם מדיום הכביסה בצורה אלכסונית.
  7. שטפו את שאריות החלמון על ידי ריסוס עדין של אמצעי הכביסה במקביל לנייר הסינון באמצעות פיפטה נקייה. יש להימנע מריסוס ישיר של אמצעי השטיפה על הממברנה.
  8. לאחר ניקוי כל החלמון, הסר בזהירות את נייר הסינון ממדיום הכביסה והשתמש בנייר טישו כדי לספוג את עודפי המדיום מהקצוות. לאחר מכן, הניחו את נייר הסינון עם העובר על צלחת התרבית, וודאו שהצד הגבי של העובר פונה כלפי מטה, כפי שמודגם באיור 5. כדי לשמור על לחות, הניחו נייר טישו לח בצלחת.
  9. העבירו את מנת התרבות לחממה על הבמה לתרבות אקס אובו .

3. מדידת ברילואין של העובר

  1. הכינו סט נוסף של כלי תרבות ומלאו אותם במדיום שטיפה. יש לוודא שמדיום הכביסה מחומם ל-37°C.
  2. כאשר העובר מגיע לשלב ההתפתחותי הרצוי, מעבירים את נייר הסינון עם העובר לצלחת התרבית המלאה במדיום שטיפה. הכניסו את מנת התרבית לחממה על הבמה של מיקרוסקופ ברילואין (ראו טבלת חומרים).
    1. לפני ביצוע מדידת Brillouin, שמור תמונת שדה בהיר של העובר כולו לעיון. התצורה המפורטת של מיקרוסקופ ברילואין תוארה בעבר30 והיא מסוכמת בסעיף התוצאות (איור 6).
  3. מדוד את אות ברילואין של מים ומתנול, אשר ישמש בשלב 4 לתהליך הכיול.
  4. התאם את עוצמת הלייזר של האירוע ואת זמן החשיפה של המצלמה למכשיר מצמיד מטען מכפיל אלקטרונים (EMCCD, ראה טבלת חומרים) כדי להשיג לפחות 10,000 ספירות של אות ברילואן. השתמש בתמונת השדה הבהיר כקו מנחה, הגדר את טווח הסריקה ואת גודל המדרגה. לרכוש תמונה Brillouin של האזור של עניין על ידי סריקת העובר באמצעות שלב תרגום דו ממדי.
    הערה: ניתן לקבוע את טווח הסריקה האופקי בהתבסס על תמונת השדה הבהיר, וניתן לקבוע את טווח הסריקה האנכי (כלומר, העומק) בהתבסס על עוצמת האות המתקבלת מסריקה מהירה וגסה. כדי למנוע נזק לאור לעובר, הגבל את עוצמת האירוע ל- 25 mW והגדר את זמן החשיפה של מצלמת EMCCD ל- 50ms. בחר גודל צעד של 2 מיקרומטר בכיוון האופקי ו- 1 מיקרומטר בכיוון האנכי כדי לאזן את איכות ההדמיה ואת זמן הרכישה.
  5. לאחר השלמת הסריקה, הסר בזהירות את נייר הסינון עם העובר והשתמש בנייר טישו כדי לספוג את כל אמצעי הכביסה העודפים. לאחר מכן, החזירו את נייר הפילטר לצלחת התרבית המלאה באלבומן דק לטיפוח רציף באינקובטור שעל הבמה.
  6. חזור על שלבים 3.2-3.5 במרווחי זמן קבועים (לדוגמה, 1.5 שעות) כדי לצלם תמונות ברילואין בהילוך מהיר עם התפתחות העובר.
  7. שחזר את תמונת Brillouin הדו-ממדית לאחר שלב 4.

4. שחזור תמונה ברילואין

  1. כייל את ספקטרומטר ברילואין באמצעות אותות ברילואין של מים ומתנול כדי לחשב את הטווח הספקטרלי החופשי (FSR) ואת יחס ההמרה בין פיקסל לתדר (PR) של הספקטרומטר30. הערכים המכוילים של FSR ו- PR ישמשו לחישוב הסטת ברילואין של העובר בכל פיקסל.
    הערה: איור 7A מציג ספקטרום ברילואין גולמי שנלכד על-ידי מצלמת EMCCD. על-ידי סיכום אנכי של הספקטרום ולאחר מכן ביצוע התאמה לורנציאנית, ניתן לקבל את מרחק השיא Δd של שתי הנקודות (איור 7B). על ידי קבלת מרחק השיא של מים Δdמים ומתנול Δdמתנול, FSR ו- PR ניתן לחשב על בסיס משוואות30: PR = 2· (ωמתנול-ω מים)/(Δd מים- Δdמתנול), ו-FSR = 2·ωמים + PR·Δdמים, עם הסטת ברילואין ידועה של מים ωמים = 6.01 GHz ומתנול ωמתנול = 4.49 GHz ב-660 ננומטר.
  2. קבל את מרחק השיא של אות Brillouin בכל פיקסל של הדגימה. חשב את הסטת ברילואין בהתבסס על FSR ו- PR מכוילים:ω sample = 0.5 (FSR - PR x Δdsample)30, כאשרω sample הוא הזזה Brillouin של הדגימה,ומדגם Δd הוא מרחק השיא של אות Brillouin.
  3. בנה מחדש את תמונת Brillouin הדו-ממדית בהתבסס על הזזות Brillouin של כל הפיקסלים.
    הערה: כדי לבצע אנליזה מקומית, ניתן לבחור אזור עניין (למשל, הלוח העצבי) מתמונת ברילואין שנרכשה ולכמת את תכונותיה המכניות. גישה נפוצה היא לחשב את השינוי הממוצע Brillouin של האזור שנבחר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 6 מראה את הסכימה של מיקרוסקופ ברילואן. המערכת משתמשת בלייזר 660 ננומטר כמקור האור. מבודד ממוקם מיד אחרי ראש הלייזר כדי לדחות כל אור המוחזר לאחור, ומסנן צפיפות נייטרלית (ND) משמש לכוונון עוצמת הלייזר. זוג עדשות, L1 ו- L2, עם אורכי מוקד של f1 = 16 מ"מ ו- f2 = 100 מ"מ, בהתאמה, משמשות להרחבת קרן הלייזר. לוח חצי גל (HWP) ומקטב ליניארי (מקטב 1) משמשים כדי להתאים את עוצמת הקרן הזוהרת על הדגימה או על חומרי הכיול (כלומר, מים ומתנול) לאחר מפצל הקרן המקוטב (PBS). כדי למקד את הלייזר לתוך הדגימה ולאסוף אור מפוזר לאחור, משתמשים בעדשה אובייקטיבית (OBJ2) עם צמצם מספרי (NA) של 0.6 והגדלה של 40. אור האירוע והאור המפוזר לאחור מופרדים על ידי אותו PBS לאחר התאמת הקיטוב באמצעות לוח רבע גל (QWP2). באופן דומה, OBJ1 ו- QWP1 משמשים להנחיית קרן הלייזר לחומרי הכיול. אות ברילואין מועבר על ידי סיב חד-מצבי לספקטרומטרברילואין 43 לצורך ניתוח. בתוך הספקטרומטר, עדשה גלילית (C1) מצמידה את אות הברילואין לאטלון הראשון של VIPA (מערך פאזות מצולם וירטואלית). הפלט של אטלון VIPA הראשון מעוצב מחדש על ידי עדשה גלילית אחרת (C2) וממוקד במסכה 1 כדי לדחות אור לייזר שאינו מפוזר. לאחר מכן, אות הברילואין מצומד לאטלון VIP שני על ידי עדשה כדורית (SL1), מעוצב מחדש על ידי עדשה כדורית אחרת (SL2), ומוקרן על מסכה 2. לאחר מכן, התבנית הספקטרלית המתקבלת עוברת דרך יחידת 4-f לדחיית רעשים ומוקרנת על EMCCD לצורך הקלטה. השתמשנו בגוף מיקרוסקופ מסחרי (ראו טבלת חומרים). באופן כללי, ניתן להשתמש בכל גוף מיקרוסקופ עם מותגים שונים כל עוד יש לו יציאה זמינה להעברת קרן האור החיצונית. האינקובטור על הבמה הוא תא מתכת עם בקרת טמפרטורה, גז וזרימת אוויר. מיקום המדגם מותאם באמצעות השלב הממונע הדו-ממדי. מצלמת מוליכים למחצה משלימה של תחמוצת מתכת (CMOS) משמשת להשגת תמונת השדה הבהיר.

איור 8 מראה את תמונות השדה הבהיר והברילואין בהילוך מהיר של עובר תרנגולת מייצג. העובר חולץ לאחר 29 שעות של תרבית אובו, והתמונות צולמו ב 29 שעות, 30.5 שעות, ו 32 שעות עם תרבית אקס אובו, אשר מתאים מספרי סומיט של 4, 5, ו 8, בהתאמה44. באופן כללי, ניתן לגדל את העובר באינקובטור על הבמה למשך 24 שעות לפחות. הקו האדום בתמונת השדה הבהיר מציין את המיקום להדמיית Brillouin. בעזרת תמונות הברילואין שנרכשו, נבחר אזור הלוח העצבי (מודגש על-ידי הקו השחור המקווקו באיור 8) וחישב את הסטת הברילואין הממוצעת של אזור זה. כפי שניתן לראות באיור 9, התזוזה הממוצעת של ברילואין של הרקמה עולה במהלך סגירת הצינור העצבי. המודולוס האורכי מחושב גם הוא על בסיס משוואה (1), כאשר הערך של Equation 3 = 1.3330 מוערך מהספרות באמצעות עוברים של דגי זברה45, בהנחה שהערך קבוע יחסית עבור סוגים דומים של רקמות ביולוגיות28,33.

Figure 1
איור 1: סכמה של כל תצורת צלחת התרבית להתפתחות עוברית. איור זה מציג נייר סינון לחיבור העובר משמאל וכלי תרבית בקוטר 35 מ"מ עם טבעת המחוברת בשכבת סרט גמישה מימין. סכמת החתך מסופקת גם כן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תהליך פתיחת קליפת הביצה מעל צלחת פטרי נקייה בקוטר 100 מ"מ כדי לחלץ את הביצה לתוך הצלחת. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מילוי הבאר המרכזית של צלחת התרבית באלבומן דק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: גרירת האלבומן העבה בכיוון המסומן על-ידי החץ האדום, באמצעות פיסת נייר טישו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: מיקום נייר הסינון בצלחת התרבית עם העובר בצד ההפוך של נייר הסינון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: סכמטי של מיקרוסקופ ברילואן. החץ האדום מציין את נתיב האור של קרן הלייזר, והחץ הכתום מציין את נתיב האור של אות ברילואן. L1, L2, SL1-SL4: עדשה כדורית; SF: מסנן מרחבי; C1, C2: עדשה גלילית, HWP: צלחת חצי גל; PBS: מפצל קרן מקוטב; QWP1, QWP2: צלחת רבע גל; OBJ1, OBJ2: עדשה אובייקטיבית; LP: זוג עדשות. VIPA: מערך בשלבים מצולם וירטואלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: אות ברילואין מייצג. (A) ספקטרום ברילואין מייצג שנלכד על-ידי EMCCD. (B) ספקטרום ברילואין מסוכם אנכית ותוצאת התאמה לורנציאנית תואמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תמונות שדה בהיר ותמונות חתך ברילואין תואמות של העובר ב-29 שעות, 30.5 שעות ו-32 שעות עם 4, 5 ו-8 סומיטים. קווים מוצקים אדומים מציינים את המיקום עבור הדמיית ברילואין, והקו המקווקו השחור מציין את אזור הלוח העצבי. השטח האפור בתמונה של 32 שעות (8 סומיטים) הוא תוצר של התאמת עקומה עקב אות ברילואין חלש והוא אינו נכלל בעת חישוב ההזזה הממוצעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: הסטת ברילואין והמודולוס האורכי המשוער של הלוח העצבי כנגד מספר הסומיט וזמן הדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההתפתחות המוקדמת של העובר יכולה להיות מושפעת בקלות מהפרעות חיצוניות. לכן, נדרשת זהירות מרבית במהלך שאיבת הדגימה והעברתה. בעיה פוטנציאלית אחת היא ניתוק העובר מנייר הפילטר, מה שעלול להוביל להתכווצות קרום הוויטלין ולגרום לממצא מוטה של הצלחת העצבית בדימות ברילואין. יתר על כן, התכווצות זו עלולה לעצור את התפתחות העובר. יש לשים לב למספר צעדים קריטיים למניעת ניתוק. ראשית, בשלב 2.4, חיוני להבטיח הסרה יסודית של אלבומן מפני השטח של הממברנה. כל אלבומן שנותר יכול לעכב את ההדבקה התקינה של הממברנה לנייר הסינון46,47. בנוסף, בתהליך הכביסה חשוב לרסס את אמצעי הכביסה בכיוון מקביל לממברנה. פגיעה ישירה בממברנה עם זרימת הנוזל עלולה לגרום לניתוק או אפילו לקרוע את הממברנה. יתר על כן, יש להשלים את כל תהליך הכביסה תוך זמן קצר (למשל <3 דקות), שכן טבילה ממושכת יכולה להוביל גם לניתוק העובר מנייר הפילטר.

לפני ביצוע מדידות Brillouin, יש צורך להעביר את העובר לצלחת עם מדיום לשטוף. הסיבה לכך היא כי שינוי Brillouin של אלבומן קרוב מאוד לרקמות צלחת עצבית, גרימת ניגודיות תמונה ירודה. הדמיה Brillouin מתקבל על ידי סריקה נקודתית, אשר יכול להיות זמן רב, במיוחד כאשר מתמודדים עם נקודות רבות. בפרוטוקול זה, אזור הסריקה הוא כ-400 מיקרומטר אופקית ופחות מ-100 מיקרומטר אנכית. כדי למנוע הפרעה להתפתחות העובר, זמן הרכישה הכולל הוגבל ל-30 דקות. זה מושג על ידי ניצול גודל צעד של 2 מיקרומטר אופקית ו 1 מיקרומטר אנכית. במקרה שמעוניינים רק בהסטת ברילואין ממוצעת של אזור מסוים, ניתן לבצע סריקה מהירה וגסה (למשל, עם גודל צעד של 4 מיקרומטר הן אופקית והן אנכית), אשר תארך פחות מ -5 דקות ויכולה למתן את ההשפעה השלילית על התפתחות העובר.

מיקרוסקופ ברילואין מציע גישת הדמיה בזמן אמת ולא פולשנית לחקר הביומכניקה של התפתחות עוברים. מגבלה אחת של שיטה זו נעוצה בעומק החדירה שלה, שהוא כ-100-200 מיקרומטר בהתאם לשלב התפתחות העובר. בעוד שהגדלת עוצמת הלייזר ו / או זמן החשיפה של EMCCD יכולה לטפל חלקית בבעיה זו, היא באה במחיר של פוטוטוקסיות פוטנציאלית ו / או זמן רכישה ארוך. לחלופין, ניתן להשתמש בטכנולוגיות אופטיות קיימות, כגון אופטיקה אדפטיבית, כדי לשפר את עומק החדירה48.

לסיכום, קבענו פרוטוקול לבדיקת התכונות המכניות של עוברי תרנגולות חיים באמצעות מיקרוסקופ ברילואן. שיטה זו ללא מגע יכולה למלא צרכים עכשוויים שלא נענו והיא משלימה לכלים קיימים אחרים לחקר ביומכניקה בהתפתחות עוברית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ע"ש יוניס קנדי שרייבר, המכונים הלאומיים לבריאות (K25HD097288, R21HD112663).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Petri dish  Fisherbrand FB0875713
2D motorized stage  Prior Scientific H117E2
35 mm Petri dish World Precision Instruments FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator N/A N/A This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs University of Connecticut N/A
CMOS camera Thorlabs CS2100M-USB
EMCCD camera Andor iXon
Ethanol Decon Laboratories, Inc. #2701
Filter paper Whatman 1004-070
Incubator for in ovo culture GQF Manufacturing Company Inc.  GQF 1502 
Ring Thorlabs SM1RR
Microscope body Olympus IX73
NaCl Sigma-Aldrich S9888
On-stage incubator Oko labs OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm Bemis PM-996
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
Pipettes Fisherbrand 13-711-6M
Scissors Artman instruments N/A 3pc Micro Scissors 5
Syringe BD 305482
Tissue paper Kimwipes N/A
Tube Corning 430052
Tweezers DR Instruments N/A Microdissection Forceps Set 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube defects. Annual Review of Neuroscience. 37 (1), 221-242 (2014).
  2. Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure. Development, Growth & Differentiation. 54 (3), 266-276 (2012).
  3. Nikolopoulou, E., Galea, G. L., Rolo, A., Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube closure: Cellular, molecular and biomechanical mechanisms. Development. 144 (4), 552-566 (2017).
  4. Juriloff, D. M., Harris, M. J. Mouse models for neural tube closure defects. Human Molecular Genetics. 9 (6), 993-1000 (2000).
  5. Copp, A. J., Greene, N. D. E. Genetics and development of neural tube defects. The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. 220 (2), 217-230 (2010).
  6. Wang, M., De Marco, P., Capra, V., Kibar, Z. Update on the role of the non-canonical wnt/planar cell polarity pathway in neural tube defects. Cells. 8 (10), 1198 (2019).
  7. Galea, G. L., et al. Biomechanical coupling facilitates spinal neural tube closure in mouse embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26), E5177-E5186 (2017).
  8. Moon, L. D., Xiong, F. Mechanics of neural tube morphogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 130, 56-69 (2022).
  9. Christodoulou, N., Skourides, P. A. Distinct spatiotemporal contribution of morphogenetic events and mechanical tissue coupling during xenopus neural tube closure. Development. 149 (13), (2022).
  10. De Goederen, V., Vetter, R., Mcdole, K., Iber, D. Hinge point emergence in mammalian spinal neurulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2117075119 (2022).
  11. Christodoulou, N., Skourides, P. A. Somitic mesoderm morphogenesis is necessary for neural tube closure during xenopus development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1091629 (2023).
  12. Nikolopoulou, E., et al. Spinal neural tube closure depends on regulation of surface ectoderm identity and biomechanics by grhl2. Nature Communications. 10 (1), 2487 (2019).
  13. Nychyk, O., et al. Vangl2-environment interaction causes severe neural tube defects, without abnormal neuroepithelial convergent extension. Disease Models & Mechanisms. 15 (1), 049194 (2022).
  14. Li, B., Brusman, L., Dahlka, J., Niswander, L. A. Tmem132a ensures mouse caudal neural tube closure and regulates integrin-based mesodermal migration. Development. 149 (17), (2022).
  15. Zulueta-Coarasa, T., Fernandez-Gonzalez, R. Laser ablation to investigate cell and tissue mechanics in vivo. Integrative Mechanobiology: Micro-and Nano Techniques in Cell Mechanobiology. , Cambridge University Press. 128-147 (2015).
  16. Wiebe, C., Brodland, G. W. Tensile properties of embryonic epithelia measured using a novel instrument. Journal of Biomechanics. 38 (10), 2087-2094 (2005).
  17. Luu, O., David, R., Ninomiya, H., Winklbauer, R. Large-scale mechanical properties of xenopus embryonic epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), 4000-4005 (2011).
  18. Maître, J. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
  19. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).
  20. Zamir, E. A., Srinivasan, V., Perucchio, R., Taber, L. A. Mechanical asymmetry in the embryonic chick heart during looping. Annals of Biomedical Engineering. 31, 1327-1336 (2003).
  21. Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1416-1421 (2015).
  22. Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476 (7358), 57-62 (2011).
  23. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nature Cell Biology. 17 (4), 470-479 (2015).
  24. Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
  25. Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 55, 119-130 (2016).
  26. Christian, Z. D., et al. High-resolution 3D biomechanical mapping of embryos with reverberant optical coherence elastography (Rev-OCE). Proceedings of SPIE. , 123670 (2023).
  27. Scarcelli, G., Yun, S. H. J. N. P. Confocal brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nature Photonics. 1 (1), 39-43 (2008).
  28. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by brillouin microscopy. Nature Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  29. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: An emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  30. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on brillouin module to confocal microscopes. Nature Protocols. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  31. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic press. (2020).
  32. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by brillouin optical microscopy. Biophysical Journal. 101 (6), 1539-1545 (2011).
  33. Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. H. Brillouin optical microscopy for corneal biomechanics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 185-190 (2012).
  34. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive brillouin microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 37217 (2016).
  35. Zhang, J., et al. Tissue biomechanics during cranial neural tube closure measured by brillouin microscopy and optical coherence tomography. Birth Defects Research. 111 (14), 991-998 (2019).
  36. Zhang, J., et al. Nuclear mechanics within intact cells is regulated by cytoskeletal network and internal nanostructures. Small. 16 (18), 1907688 (2020).
  37. Elsayad, K., Polakova, S., Gregan, J. Probing mechanical properties in biology using brillouin microscopy. Trends in Cell Biology. 29 (8), 608-611 (2019).
  38. Poon, C., Chou, J., Cortie, M., Kabakova, I. Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: From current state-of-the-art to future clinical translation. Journal of Physics: Photonics. 3 (1), 012002 (2020).
  39. Handler, C., Scarcelli, G., Zhang, J. Time-lapse mechanical imaging of neural tube closure in live embryo using brillouin microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 263 (2023).
  40. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 220 (3), 284-289 (2001).
  41. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e54636 (2016).
  42. Nys, Y., Guyot, N. Improving the safety and quality of eggs and egg products, vol 1: Egg chemistry, production and consumption. Nys, Y., Bain, M., VanImmerseel, F. , 83-132 (2011).
  43. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis. Journal of Visualized Experiments. (106), e53468 (2015).
  44. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  45. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  46. Williams, R. M., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
  47. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  48. Edrei, E., Scarcelli, G. Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications. Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 201
מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, C., Handler, C., Florn, H.,… More

Shi, C., Handler, C., Florn, H., Zhang, J. Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo. J. Vis. Exp. (201), e66117, doi:10.3791/66117 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter