Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

مراقبة التطور الميكانيكي للأنسجة أثناء إغلاق الأنبوب العصبي لجنين الفرخ

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66117
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Wayne State University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

تم تطوير هذا البروتوكول لمراقبة الخصائص الميكانيكية لأنسجة الصفيحة العصبية طوليا أثناء تعصيب جنين الفرخ. يعتمد على دمج مجهر بريلوين ونظام حضانة على خشبة المسرح ، مما يتيح التصوير الميكانيكي الحي لأنسجة الصفيحة العصبية في أجنة الكتاكيت المستزرعة خارج البويضات .

Abstract

إغلاق الأنبوب العصبي (NTC) هو عملية حاسمة أثناء التطور الجنيني. يمكن أن يؤدي الفشل في هذه العملية إلى عيوب الأنبوب العصبي ، مما يسبب تشوهات خلقية أو حتى الوفيات. يتضمن NTC سلسلة من الآليات على المستويات الوراثية والجزيئية والميكانيكية. في حين أن التنظيم الميكانيكي أصبح موضوعا جذابا بشكل متزايد في السنوات الأخيرة ، إلا أنه لا يزال غير مستكشف إلى حد كبير بسبب عدم وجود تقنية مناسبة لإجراء الاختبارات الميكانيكية للأنسجة الجنينية 3D في الموقع. استجابة لذلك ، قمنا بتطوير بروتوكول لتحديد الخواص الميكانيكية للأنسجة الجنينية للدجاج بطريقة غير ملامسة وغير جراحية. يتم تحقيق ذلك من خلال دمج مجهر بريلوين متحد البؤر مع نظام حضانة على المسرح. لفحص ميكانيكا الأنسجة ، يتم جمع جنين مزروع مسبقا ونقله إلى حاضنة على خشبة المسرح لزراعة البويضات السابقة . في الوقت نفسه ، يتم الحصول على الصور الميكانيكية لأنسجة الصفيحة العصبية بواسطة مجهر بريلوين في نقاط زمنية مختلفة أثناء التطوير. يتضمن هذا البروتوكول وصفا مفصلا لإعداد العينات ، وتنفيذ تجارب الفحص المجهري Brillouin ، والمعالجة اللاحقة للبيانات وتحليلها. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين دراسة التطور الميكانيكي للأنسجة الجنينية أثناء التطور طوليا.

Introduction

عيوب الأنبوب العصبي (NTDs) هي عيوب خلقية شديدة في الجهاز العصبي المركزي ناتجة عن الفشل في إغلاق الأنبوب العصبي (NTC) أثناء التطور الجنيني1. مسببات أمراض المناطق المدارية المهملة معقدة. أظهرت الدراسات أن NTC ينطوي على سلسلة من العمليات المورفولوجية ، بما في ذلك التمديد المتقارب ، وثني الصفيحة العصبية (على سبيل المثال ، الانقباض القمي) ، ورفع الطية العصبية ، وأخيرا التصاق الطية العصبية. وتنظم هذه العمليات آليات جزيئية وجينية متعددة 2,3، وأي خلل في هذه العمليات قد يؤدي إلى أمراض المناطق المدارية المهملة 4,5,6. نظرا لأن الأدلة المتزايدة تشير إلى أن الإشارات الميكانيكية تلعب أيضا أدوارا حاسمة خلال NTC3،7،8،9،10،11 ، وقد تم العثور على علاقات بين الجينات والإشارات الميكانيكية12،13،14 ، يصبح من الضروري التحقيق في الميكانيكا الحيوية للأنسجة أثناء العصبية.

تم تطوير العديد من التقنيات لقياس الخواص الميكانيكية للأنسجة الجنينية ، بما في ذلك الاستئصال بالليزر (LA) 15 ، تشريح الأنسجة وانبساطها (TDR) 16،17 ، شفط الماصة الدقيقة (MA) 18 ، المسافة البادئة النانوية القائمة على مجهر القوة الذرية (AFM)19 ، microindenter (MI) والألواح الدقيقة (MP) 20 ، الريولوجيا الدقيقة (MR) مع ملاقط بصرية / مغناطيسية21،22،23، وأجهزة الاستشعار القائمة على القطيرات24. يمكن للطرق الحالية قياس الخواص الميكانيكية بدقة مكانية تتراوح من المقاييس تحت الخلوية إلى مقاييس الأنسجة. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الطرق غازية لأنها تتطلب ملامسة العينة (على سبيل المثال ، MA و AFM و MI و MP) ، أو حقن المواد الخارجية (على سبيل المثال ، أجهزة الاستشعار القائمة على التصوير بالرنين المغناطيسي والقطرات) ، أو تشريح الأنسجة (على سبيل المثال ، LA و TDR). نتيجة لذلك ، من الصعب على الطرق الحالية مراقبة التطور الميكانيكي لأنسجة الصفيحة العصبية في الموقع25. في الآونة الأخيرة ، أظهر التصوير الإلستوجرافي للتماسك البصري الصدى وعدا لرسم الخرائط الميكانيكية غير الملامسة بدقة مكانية عالية26.

الفحص المجهري Brillouin Confocal هو طريقة بصرية ناشئة تتيح القياس الكمي غير المتصل للميكانيكا الحيوية للأنسجة بدقة تحت الخلوية27،28،29،30. يعتمد الفحص المجهري Brillouin على مبدأ تشتت ضوء Brillouin التلقائي ، وهو التفاعل بين ضوء الليزر الساقط والموجة الصوتية الناتجة عن التقلبات الحرارية داخل المادة. وبالتالي ، فإن الضوء المبعثر يتعرض لتحول تردد ، يعرف باسم إزاحة بريلوين ωR ، باتباع المعادلة31:

Equation 1 (1)

هنا ، Equation 2 هو معامل الانكسار للمادة ، λ هو الطول الموجي للضوء الساقط ، M ' هو المعامل الطولي ، ρ هي كثافة الكتلة ، و θ هي الزاوية بين الضوء الساقط والضوء المتناثر. بالنسبة لنفس النوع من المواد البيولوجية ، تكون نسبة معامل الانكسار والكثافة Equation 3 ثابتة تقريبا28،32،33،34،35،36. وبالتالي ، يمكن استخدام تحول بريلوين مباشرة لتقدير التغيرات الميكانيكية النسبية في العمليات الفسيولوجية. تم التحقق من جدوى الفحص المجهري Brillouin في عينات بيولوجية مختلفة29،37،38. في الآونة الأخيرة ، تم عرض التصوير الميكانيكي بفاصل زمني لجنين كتكوت حي من خلال الجمع بين مجهر بريلوين ونظام حضانة على خشبة المسرح39. يوفر هذا البروتوكول وصفا تفصيليا لإعداد العينات وتنفيذ التجربة ومعالجة البيانات وتحليلها بعد المعالجة. نأمل أن يسهل هذا الجهد الاعتماد الواسع النطاق لتقنية Brillouin غير الملامسة لدراسة التنظيم الميكانيكي الحيوي في تطور الجنين والعيوب الخلقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة واين ستيت.

1. التحضير التجريبي

  1. استخدم محلول إيثانول بنسبة 70٪ لتنظيف وتعقيم المقص والملاقط. أيضا ، إعداد ماصات يمكن التخلص منها وحقنة.
  2. قم بإعداد وسط غسيل بإضافة 3.595 جم من كلوريد الصوديوم إلى 495 مل من الماء منزوع الأيونات. ثم أضف 5 مل من البنسلين والستربتومايسين (5 وحدة / مل) إلى الوسط. املأ طبق بتري 100 مم بوسط الغسيل وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
  3. قم بإعداد أطباق الاستزراع وفقا للشكل 1 ، الذي يوضح التكوين العام.
    1. قم بإعداد قطعة من ورق الترشيح ، وقم بتقطيعها إلى شكل مستطيل يبلغ حوالي 17 مم × 20 مم ، وقم بإزالة الزوايا الأربع. قم بإنشاء مركز مجوف في ورق الترشيح ، بحجم 7 مم × 10 مم تقريبا لتأمين الجنين (الشكل 1 ، يسار).
      ملاحظة: يتم وصف جمع الأجنة في الخطوة 2.
    2. قم بتوصيل حلقة تجارية متاحة (Φ = 1 بوصة ، انظر جدول المواد) بطبقة فيلم مرنة (أي فيلم البارافين) ، مما يضمن أن الفيلم المرن يحتوي أيضا على مركز مجوف. سيتم استخدام هذه الحلقة مع الفيلم لتثبيت ورقة الترشيح مع الجنين.
    3. أخيرا ، ضع الحلقة المحضرة في طبق بتري 35 مم (الشكل 1 ، يمين).
      ملاحظة: ورق الترشيح مخصص لتأمين الجنين المستخرج وتثبيته عن طريق وضع ورق الترشيح على الغشاء وترك الجنين في المنطقة المجوفة المركزية (والتي سيتم تفصيلها في الخطوة 2). تم قطع الزوايا الأربع لتناسب حجم الحلقة الخارجية (ليس ضروريا إذا كانت مثبتة بالفعل). يتم استخدام طبق استزراع ذو قاع زجاجي 35 مم لتحسين انتشار شعاع الليزر. يحتوي الطبق على بئر داخلي (Φ = 23 مم) ، والذي يمكن ملؤه بالزلال لثقافة البيض السابقة . يجب أن يكون قطر الحلقة أكبر من قطر البئر الداخلي بحيث يمكن تغطية البئر بالفيلم المرن على الحلقة (الشكل 1 ، أقحم). حجم ورق الترشيح غير مقيد ويمكن تعديله وفقا لحجم الحلقة المختارة وطبق الاستزراع. بدلا من ذلك ، يمكن طلاء قاع الطبق مسبقا بطبقة من الأغاروز (سمك: ~ 1 مم). عن طريق إزالة الأغاروز من وسط الطبقة باستخدام شفرة ، يمكن إنشاء بئر ذو شكل مشابه للمركز المجوف للفيلم المرن لتحميل الزلال. إحدى النقاط الحرجة هي أن الجوانب الأربعة لورق الترشيح المجوف يجب أن يكون لها عرض كاف (> 5 مم) لضمان ارتباط الجنين.

2. استخراج وزراعة البيض من جنين الدجاج

ملاحظة: تم تعديل هذه الخطوة من التقارير المنشورة مسبقا40,41.

  1. بعد ما قبل الاستزراع ، استرجع البويضة من الحاضنة وضعها على محورها الطويل على صينية كرتون البيض. نظف قشر البيض بنسبة 70٪ من الإيثانول ، مع التأكد من تغطية السطح بالكامل ، ثم اتركه يرتاح لمدة 15 دقيقة.
  2. امسك البيضة على محورها القصير وكسرها في الأسفل. افتح البيضة على طبق بتري نظيف 100 مم لاستخراج محتوياتها ، كما هو موضح في الشكل 2. تأكد من عدم تدوير البيضة أثناء حملها وتكسيرها.
  3. باستخدام ماصة ، قم بنقل وجمع ما يقرب من 10 مل من الزلال الرقيق (أي الزلال السائل42) في أنبوب سعة 15 مل لاستخدام زراعة البويضات السابقة . املأ البئر المركزي لطبق الاستزراع بالزلال الرقيق الذي تم جمعه (حوالي 0.9 مل) ، كما هو موضح في الشكل 3. يجب أن تكون عملية التعبئة بطيئة ، وتجنب تكوين أي فقاعات داخل البئر. تأكد من تسخين طبق الاستزراع مع الزلال إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذا الطبق لزراعة الجنين خارج البيض. سيتم استخدام أطباق استزراع جديدة مملوءة بوسط الغسيل أثناء تصوير بريلوين (انظر الخطوة 3).
  4. باستخدام المناديل الورقية، أزل الزلال السميك (أي الزلال اللزج) المرتبط بالجنين برفق عن طريق فصل الزلال بعناية عن الغشاء اللاصق، كما هو موضح في الشكل 4. تجنب الاتصال المباشر مع غشاء vitelline.
  5. بعد إزالة كل الزلال السميك ، قم بتثبيت ورق الترشيح بعناية على غشاء vitelline. تأكد من محاذاة محور جسم الجنين مع المحور الطويل للمستطيل المركزي على ورق الترشيح. استخدم المقص لقطع الغشاء المحيط بورق الترشيح.
  6. باستخدام الملقط ، اسحب ورق الترشيح المعزول برفق بعيدا عن صفار البيض في اتجاه مائل. اقلب ورقة الترشيح رأسا على عقب لوضع الجنين مع جانبه الظهري لأسفل (لتكوين المجهر المقلوب). اغمر ورق الترشيح بالكامل بعناية من جانب واحد من المحور الطويل في طبق بتري مقاس 100 مم باستخدام وسيط الغسيل بطريقة مائلة.
  7. اغسل أي صفار متبقي عن طريق رش وسط الغسيل برفق مواز لورق الترشيح باستخدام ماصة نظيفة. تجنب رش وسيط الغسيل مباشرة على الغشاء.
  8. بعد إزالة كل صفار البيض ، قم بإزالة ورق الترشيح بعناية من وسط الغسيل واستخدم المناديل الورقية لامتصاص أي وسيط زائد من الحواف. بعد ذلك، ضع ورقة الترشيح مع الجنين على طبق المستزرع، مع التأكد من أن الجانب الظهري للجنين متجها لأسفل، كما هو موضح في الشكل 5. للحفاظ على الرطوبة ، ضع مناديل مبللة في الطبق.
  9. انقل طبق الثقافة إلى الحاضنة على خشبة المسرح لثقافة البيض السابقة .

3. قياس بريلوين للجنين

  1. تحضير مجموعة أخرى من أطباق الثقافة وملء لهم المتوسطة غسل. تأكد من تسخين وسط الغسيل إلى 37 درجة مئوية.
  2. عندما يصل الجنين إلى مرحلة النمو المطلوبة ، انقل ورق الترشيح مع الجنين إلى طبق الاستزراع المملوء بوسط الغسيل. ضع طبق الاستزراع في حاضنة مجهر بريلوين على خشبة المسرح (انظر جدول المواد).
    1. قبل إجراء قياس Brillouin ، احفظ صورة المجال الساطع للجنين بأكمله كمرجع. تم وصف التكوين التفصيلي لمجهر بريلوين سابقا30 وتم تلخيصه في قسم النتائج (الشكل 6).
  3. قم بقياس إشارة Brillouin للماء والميثانول ، والتي سيتم استخدامها في الخطوة 4 لعملية المعايرة.
  4. اضبط وقت التعرض للكاميرا لطاقة الليزر الساقطة وجهاز اقتران الشحنة المضاعف للإلكترون (EMCCD، انظر جدول المواد) لتحقيق ما لا يقل عن 10000 عدد من إشارات Brillouin. باستخدام صورة المجال الساطع كدليل، قم بإعداد نطاق المسح الضوئي وحجم الخطوة. الحصول على صورة Brillouin للمنطقة محل الاهتمام عن طريق مسح الجنين باستخدام مرحلة الترجمة 2D.
    ملاحظة: يمكن تحديد نطاق المسح الأفقي بناء على صورة المجال الساطع ، ويمكن تحديد نطاق المسح الرأسي (أي العمق) بناء على قوة الإشارة التي تم الحصول عليها من المسح السريع والخشن. لمنع أي تلف ضوئي للجنين ، حدد طاقة الحادث إلى 25 ميجاوات ، واضبط وقت التعرض لكاميرا EMCCD على 50 مللي ثانية. اختر حجم خطوة 2 ميكرومتر في الاتجاه الأفقي و 1 ميكرومتر في الاتجاه الرأسي لتحقيق التوازن بين جودة التصوير ووقت الاستحواذ.
  5. بعد الانتهاء من الفحص ، قم بإزالة ورق الترشيح بعناية مع الجنين واستخدم المناديل الورقية لامتصاص أي وسيط غسيل زائد. بعد ذلك ، ضع ورق الترشيح مرة أخرى في طبق الاستزراع المملوء بالزلال الرقيق للزراعة المستمرة في الحاضنة على المسرح.
  6. كرر الخطوات 3.2-3.5 على فترات زمنية منتظمة (على سبيل المثال ، 1.5 ساعة) لالتقاط صور بريلوين ذات الفاصل الزمني أثناء نمو الجنين.
  7. أعد بناء صورة 2D Brillouin باتباع الخطوة 4.

4. إعادة بناء صورة بريلوين

  1. معايرة مطياف بريلوين باستخدام إشارات بريلوين للماء والميثانول لحساب النطاق الطيفي الحر (FSR) ونسبة تحويل البكسل إلى التردد (PR) لمقياس الطيف30. سيتم استخدام القيم المعايرة ل FSR و PR لحساب إزاحة Brillouin للجنين عند كل بكسل.
    ملاحظة: يعرض الشكل 7A طيف بريلوين الخام الذي تم التقاطه بواسطة كاميرا EMCCD. من خلال جمع الطيف عموديا ثم القيام بتركيب لورنتزيان ، يمكن الحصول على مسافة الذروة Δd للنقطتين (الشكل 7B). من خلال الحصول على مسافة الذروة من الماء Δdالماء والميثانول Δdالميثانول ، يمكن حساب FSR و PR بناء على المعادلات30: PR = 2 · (ωالميثانول - ωالماء) / (Δd الماء - Δdالميثانول) ، و FSR = 2 · ωالماء + PR ·Δd الماء ، مع تحول بريلوين المعروف للمياه ωالماء = 6.01 جيجا هرتز والميثانول ωالميثانول = 4.49 جيجا هرتز عند 660 نانومتر.
  2. احصل على مسافة الذروة لإشارة Brillouin عند كل بكسل من العينة. احسب إزاحة بريلوين بناء على FSR و PR المعارين:ω sample = 0.5 (FSR -PR x Δd sample) 30 ، حيث ωالعينة هي إزاحة بريلوين للعينة ،وعينة Δd هي مسافة الذروة لإشارة بريلوين.
  3. أعد بناء صورة 2D Brillouin بناء على إزاحات Brillouin لجميع وحدات البكسل.
    ملاحظة: لإجراء تحليل محلي ، يمكن للمرء اختيار منطقة الاهتمام (على سبيل المثال ، اللوحة العصبية) من صورة Brillouin المكتسبة وتحديد خصائصها الميكانيكية. النهج الشائع هو حساب متوسط تحول بريلوين للمنطقة المختارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 6 الرسم التخطيطي لمجهر بريلوين. يستخدم النظام ليزر 660 نانومتر كمصدر للضوء. يتم وضع عازل مباشرة بعد رأس الليزر لرفض أي ضوء منعكس من الخلف ، ويتم استخدام مرشح الكثافة المحايدة (ND) لضبط طاقة الليزر. يتم استخدام زوج من العدسات ، L1 و L2 ، بأطوال بؤرية f1 = 16 مم و f2 = 100 مم ، على التوالي ، لتوسيع شعاع الليزر. يتم استخدام لوحة نصف موجية (HWP) ومستقطب خطي (Polarizer 1) لضبط قوة الحزمة الساطعة على العينة أو مواد المعايرة (أي الماء والميثانول) بعد مقسم الحزمة المستقطبة (PBS). لتركيز الليزر في العينة وجمع الضوء المبعثر للخلف ، يتم استخدام عدسة موضوعية (OBJ2) بفتحة عددية (NA) تبلغ 0.6 وتكبير 40. يتم فصل الضوء الساقط والضوء المتناثر للخلف بواسطة نفس PBS بعد ضبط الاستقطاب باستخدام لوحة ربع موجة (QWP2). وبالمثل ، يتم استخدام OBJ1 و QWP1 لتوجيه شعاع الليزر إلى مواد المعايرة. يتم تسليم إشارة Brillouin بواسطة ألياف أحادية الوضع إلى مطياف Brillouin43 لتحليلها. داخل مقياس الطيف ، تقوم عدسة أسطوانية (C1) بإقران إشارة Brillouin في أول VIPA (صفيف مرحلي مصور تقريبا) etalon. يتم إعادة تشكيل إخراج أول VIPA etalon بواسطة عدسة أسطوانية أخرى (C2) وتركيزه على القناع 1 لرفض ضوء الليزر غير المتناثر. بعد ذلك ، تقترن إشارة Brillouin ب VIPA etalon ثان بواسطة عدسة كروية (SL1) ، ويعاد تشكيلها بواسطة عدسة كروية أخرى (SL2) ، ويتم إسقاطها على القناع 2. ثم يمر النمط الطيفي الناتج عبر وحدة 4-f لرفض الضوضاء ويتم إسقاطه على EMCCD للتسجيل. استخدمنا جسم مجهر تجاري (انظر جدول المواد). بشكل عام ، يمكن استخدام أي جسم مجهر بعلامات تجارية مختلفة طالما أنه يحتوي على منفذ متاح لتوصيل شعاع الضوء الخارجي. الحاضنة على خشبة المسرح عبارة عن غرفة معدنية مع التحكم في درجة الحرارة والغاز وتدفق الهواء. يتم ضبط موضع العينة عبر المرحلة الآلية 2D. يتم استخدام كاميرا تكميلية لأشباه الموصلات المعدنية (CMOS) للحصول على صورة المجال الساطع.

يوضح الشكل 8 صور المجال الساطع وبريلوين ذات الفاصل الزمني لجنين دجاج تمثيلي. تم استخراج الجنين بعد 29 ساعة من زراعة البويضات ، وتم التقاط الصور في 29 ساعة و 30.5 ساعة و 32 ساعة مع زراعة البويضات السابقة ، والتي تتوافق مع أعداد سوميت 4 و 5 و 8 ، على التوالي44. بشكل عام ، يمكن زراعة الجنين في الحاضنة على خشبة المسرح لمدة 24 ساعة على الأقل. يشير الخط الأحمر في صورة المجال الساطع إلى موقع تصوير بريلوين. باستخدام صور Brillouin المكتسبة ، تم اختيار منطقة الصفيحة العصبية (تم تمييزها بالخط المنقط الأسود في الشكل 8) وحساب متوسط إزاحة Brillouin لهذه المنطقة. كما هو موضح في الشكل 9 ، يزداد متوسط إزاحة بريلوين للأنسجة أثناء إغلاق الأنبوب العصبي. يتم حساب المعامل الطولي أيضا بناء على المعادلة (1) ، حيث يتم تقدير قيمة Equation 3 = 1.3330 من الأدبيات باستخدام أجنة الزرد45 ، بافتراض أن القيمة ثابتة نسبيا لأنواع مماثلة من الأنسجة البيولوجية28,33.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لتكوين طبق الاستزراع بالكامل للتطور الجنيني. يوضح هذا الشكل ورقة ترشيح لربط الجنين على اليسار وطبق استزراع 35 مم مع حلقة متصلة بطبقة فيلم مرنة على اليمين. كما يتم توفير مخطط المقطع العرضي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: عملية فتح قشر البيض فوق طبق بتري نظيف 100 مم لاستخراج البيضة في الطبق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: ملء البئر المركزي لطبق الاستزراع بالزلال الرقيق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: اسحب الزلال السميك بعيدا في الاتجاه المشار إليه بالسهم الأحمر، باستخدام قطعة من المناديل الورقية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: وضع ورقة الترشيح في طبق الاستزراع مع وضع الجنين على الجانب العلوي من ورقة الترشيح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: رسم تخطيطي لمجهر بريلوين. يشير السهم الأحمر إلى مسار الضوء لشعاع الليزر ، ويشير السهم البرتقالي إلى مسار الضوء لإشارة Brillouin. L1 ، L2 ، SL1-SL4: عدسة كروية ؛ SF: مرشح مكاني ؛ C1 ، C2: عدسة أسطوانية ، HWP: لوحة نصف موجة ؛ PBS: مقسم شعاع مستقطب ؛ QWP1 ، QWP2: لوحة ربع موجة ؛ OBJ1 ، OBJ2: عدسة موضوعية ؛ LP: زوج العدسات. VIPA: صفيف مرحلي مصور تقريبا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: إشارة بريلوين التمثيلية. (أ) طيف بريلوين التمثيلي الذي تم التقاطه بواسطة EMCCD. (ب) طيف بريلوين الحاصل رأسيا ونتيجة تركيب لورنتزيان المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: صور المجال الساطع وصور المقطع العرضي للجنين عند 29 ساعة و 30.5 ساعة و 32 ساعة مع 4 و 5 و 8 سوميت. تشير الخطوط الصلبة الحمراء إلى موقع تصوير بريلوين ، ويشير الخط المنقط الأسود إلى منطقة الصفيحة العصبية. المنطقة الرمادية في الصورة 32 ساعة (8 سوميت) هي قطعة أثرية لتركيب المنحنى بسبب ضعف إشارة بريلوين ويتم استبعادها عند حساب متوسط الإزاحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: إزاحة بريلوين والمعامل الطولي المقدر للصفيحة العصبية مقابل عدد السوميت ووقت الحضانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن أن يتأثر التطور المبكر للجنين بسهولة بالاضطرابات الخارجية. لذلك ، يجب توخي أقصى درجات الحذر أثناء استخراج العينة ونقلها. إحدى المشكلات المحتملة هي انفصال الجنين عن ورقة الترشيح ، مما قد يؤدي إلى تقلص غشاء vitelline ويؤدي إلى قطعة أثرية مائلة من اللوحة العصبية في تصوير Brillouin. علاوة على ذلك ، قد يوقف هذا الانكماش تطور الجنين. يجب الانتباه إلى عدة خطوات حاسمة لمنع الانفصال. أولا ، في الخطوة 2.4 ، من الأهمية بمكان ضمان الإزالة الشاملة للزلال من سطح الغشاء. أي زلال متبقي يمكن أن يعيق الالتصاق الغشاء المناسب بورق الترشيح46,47. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء عملية الغسيل ، من المهم رش وسط الغسيل في اتجاه مواز للغشاء. قد يؤدي ضرب الغشاء مباشرة بتدفق السائل إلى انفصال الغشاء أو حتى تمزقه. علاوة على ذلك ، يجب إكمال عملية الغسيل بأكملها في غضون فترة زمنية قصيرة (على سبيل المثال ، <3 دقائق) ، حيث يمكن أن يؤدي الغمر المطول أيضا إلى انفصال الجنين عن ورق الترشيح.

قبل إجراء قياسات Brillouin ، من الضروري نقل الجنين إلى طبق مع وسط غسيل. وذلك لأن تحول بريلوين للزلال قريب جدا من أنسجة الصفيحة العصبية ، مما يتسبب في ضعف تباين الصورة. يتم الحصول على تصوير Brillouin عن طريق مسح النقاط ، والذي يمكن أن يستغرق وقتا طويلا ، خاصة عند التعامل مع العديد من النقاط. في هذا البروتوكول ، تبلغ منطقة المسح حوالي 400 ميكرومتر أفقيا وأقل من 100 ميكرومتر رأسيا. لتجنب اضطراب نمو الجنين ، اقتصر إجمالي وقت الاستحواذ على 30 دقيقة. يتم تحقيق ذلك من خلال استخدام حجم خطوة 2 ميكرومتر أفقيا و 1 ميكرومتر رأسيا. في حال كان المرء مهتما فقط بمتوسط تحول بريلوين لمنطقة معينة ، يمكن إجراء مسح سريع وخشن (على سبيل المثال ، بحجم خطوة يبلغ 4 ميكرومتر أفقيا ورأسيا) ، والذي سيستغرق أقل من 5 دقائق ويمكن أن يخفف من التأثير السلبي على نمو الجنين.

يوفر الفحص المجهري Brillouin نهج تصوير في الوقت الفعلي وغير جراحي للتحقيق في الميكانيكا الحيوية لتطور الجنين. يكمن أحد قيود هذه الطريقة في عمق اختراقها ، والذي يتراوح بين 100 و 200 ميكرومتر اعتمادا على مرحلة تطور الجنين. في حين أن زيادة طاقة الليزر و / أو وقت التعرض ل EMCCD يمكن أن يعالج هذه المشكلة جزئيا ، إلا أنه يأتي على حساب السمية الضوئية المحتملة و / أو وقت الاستحواذ الطويل. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام التقنيات البصرية الحالية ، مثل البصريات التكيفية ، لتحسين عمق الاختراق48.

في الختام ، أنشأنا بروتوكولا لفحص الخواص الميكانيكية لأجنة الدجاج الحية باستخدام مجهر بريلوين. يمكن أن تلبي طريقة عدم الاتصال هذه الاحتياجات الحالية غير الملباة وهي مكملة للأدوات الأخرى الموجودة لدراسة الميكانيكا الحيوية في التطور الجنيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من قبل معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، المعاهد الوطنية للصحة (K25HD097288 ، R21HD112663).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Petri dish  Fisherbrand FB0875713
2D motorized stage  Prior Scientific H117E2
35 mm Petri dish World Precision Instruments FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator N/A N/A This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs University of Connecticut N/A
CMOS camera Thorlabs CS2100M-USB
EMCCD camera Andor iXon
Ethanol Decon Laboratories, Inc. #2701
Filter paper Whatman 1004-070
Incubator for in ovo culture GQF Manufacturing Company Inc.  GQF 1502 
Ring Thorlabs SM1RR
Microscope body Olympus IX73
NaCl Sigma-Aldrich S9888
On-stage incubator Oko labs OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm Bemis PM-996
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
Pipettes Fisherbrand 13-711-6M
Scissors Artman instruments N/A 3pc Micro Scissors 5
Syringe BD 305482
Tissue paper Kimwipes N/A
Tube Corning 430052
Tweezers DR Instruments N/A Microdissection Forceps Set 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube defects. Annual Review of Neuroscience. 37 (1), 221-242 (2014).
  2. Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure. Development, Growth & Differentiation. 54 (3), 266-276 (2012).
  3. Nikolopoulou, E., Galea, G. L., Rolo, A., Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube closure: Cellular, molecular and biomechanical mechanisms. Development. 144 (4), 552-566 (2017).
  4. Juriloff, D. M., Harris, M. J. Mouse models for neural tube closure defects. Human Molecular Genetics. 9 (6), 993-1000 (2000).
  5. Copp, A. J., Greene, N. D. E. Genetics and development of neural tube defects. The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. 220 (2), 217-230 (2010).
  6. Wang, M., De Marco, P., Capra, V., Kibar, Z. Update on the role of the non-canonical wnt/planar cell polarity pathway in neural tube defects. Cells. 8 (10), 1198 (2019).
  7. Galea, G. L., et al. Biomechanical coupling facilitates spinal neural tube closure in mouse embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26), E5177-E5186 (2017).
  8. Moon, L. D., Xiong, F. Mechanics of neural tube morphogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 130, 56-69 (2022).
  9. Christodoulou, N., Skourides, P. A. Distinct spatiotemporal contribution of morphogenetic events and mechanical tissue coupling during xenopus neural tube closure. Development. 149 (13), (2022).
  10. De Goederen, V., Vetter, R., Mcdole, K., Iber, D. Hinge point emergence in mammalian spinal neurulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2117075119 (2022).
  11. Christodoulou, N., Skourides, P. A. Somitic mesoderm morphogenesis is necessary for neural tube closure during xenopus development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1091629 (2023).
  12. Nikolopoulou, E., et al. Spinal neural tube closure depends on regulation of surface ectoderm identity and biomechanics by grhl2. Nature Communications. 10 (1), 2487 (2019).
  13. Nychyk, O., et al. Vangl2-environment interaction causes severe neural tube defects, without abnormal neuroepithelial convergent extension. Disease Models & Mechanisms. 15 (1), 049194 (2022).
  14. Li, B., Brusman, L., Dahlka, J., Niswander, L. A. Tmem132a ensures mouse caudal neural tube closure and regulates integrin-based mesodermal migration. Development. 149 (17), (2022).
  15. Zulueta-Coarasa, T., Fernandez-Gonzalez, R. Laser ablation to investigate cell and tissue mechanics in vivo. Integrative Mechanobiology: Micro-and Nano Techniques in Cell Mechanobiology. , Cambridge University Press. 128-147 (2015).
  16. Wiebe, C., Brodland, G. W. Tensile properties of embryonic epithelia measured using a novel instrument. Journal of Biomechanics. 38 (10), 2087-2094 (2005).
  17. Luu, O., David, R., Ninomiya, H., Winklbauer, R. Large-scale mechanical properties of xenopus embryonic epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), 4000-4005 (2011).
  18. Maître, J. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
  19. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).
  20. Zamir, E. A., Srinivasan, V., Perucchio, R., Taber, L. A. Mechanical asymmetry in the embryonic chick heart during looping. Annals of Biomedical Engineering. 31, 1327-1336 (2003).
  21. Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1416-1421 (2015).
  22. Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476 (7358), 57-62 (2011).
  23. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nature Cell Biology. 17 (4), 470-479 (2015).
  24. Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
  25. Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 55, 119-130 (2016).
  26. Christian, Z. D., et al. High-resolution 3D biomechanical mapping of embryos with reverberant optical coherence elastography (Rev-OCE). Proceedings of SPIE. , 123670 (2023).
  27. Scarcelli, G., Yun, S. H. J. N. P. Confocal brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nature Photonics. 1 (1), 39-43 (2008).
  28. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by brillouin microscopy. Nature Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  29. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: An emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  30. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on brillouin module to confocal microscopes. Nature Protocols. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  31. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic press. (2020).
  32. Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by brillouin optical microscopy. Biophysical Journal. 101 (6), 1539-1545 (2011).
  33. Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. H. Brillouin optical microscopy for corneal biomechanics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 185-190 (2012).
  34. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive brillouin microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 37217 (2016).
  35. Zhang, J., et al. Tissue biomechanics during cranial neural tube closure measured by brillouin microscopy and optical coherence tomography. Birth Defects Research. 111 (14), 991-998 (2019).
  36. Zhang, J., et al. Nuclear mechanics within intact cells is regulated by cytoskeletal network and internal nanostructures. Small. 16 (18), 1907688 (2020).
  37. Elsayad, K., Polakova, S., Gregan, J. Probing mechanical properties in biology using brillouin microscopy. Trends in Cell Biology. 29 (8), 608-611 (2019).
  38. Poon, C., Chou, J., Cortie, M., Kabakova, I. Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: From current state-of-the-art to future clinical translation. Journal of Physics: Photonics. 3 (1), 012002 (2020).
  39. Handler, C., Scarcelli, G., Zhang, J. Time-lapse mechanical imaging of neural tube closure in live embryo using brillouin microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 263 (2023).
  40. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 220 (3), 284-289 (2001).
  41. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e54636 (2016).
  42. Nys, Y., Guyot, N. Improving the safety and quality of eggs and egg products, vol 1: Egg chemistry, production and consumption. Nys, Y., Bain, M., VanImmerseel, F. , 83-132 (2011).
  43. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis. Journal of Visualized Experiments. (106), e53468 (2015).
  44. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  45. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  46. Williams, R. M., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
  47. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  48. Edrei, E., Scarcelli, G. Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications. Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 201 ،
مراقبة التطور الميكانيكي للأنسجة أثناء إغلاق الأنبوب العصبي لجنين الفرخ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, C., Handler, C., Florn, H.,… More

Shi, C., Handler, C., Florn, H., Zhang, J. Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo. J. Vis. Exp. (201), e66117, doi:10.3791/66117 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter