Summary
Detta protokoll utvecklades för att longitudinellt övervaka de mekaniska egenskaperna hos neuralplattevävnad under kycklingembryoneurulation. Den är baserad på integrationen av ett Brillouin-mikroskop och ett inkubationssystem på scenen, vilket möjliggör levande mekanisk avbildning av neuralplattevävnad i ex ovo-odlade kycklingembryon.
Abstract
Neuralrörsstängning (NTC) är en kritisk process under embryonal utveckling. Misslyckande i denna process kan leda till neuralrörsdefekter, vilket orsakar medfödda missbildningar eller till och med dödlighet. NTC involverar en rad mekanismer på genetisk, molekylär och mekanisk nivå. Även om mekanisk reglering har blivit ett allt mer attraktivt ämne under de senaste åren, är det fortfarande till stor del outforskat på grund av bristen på lämplig teknik för att utföra mekanisk testning av 3D-embryonal vävnad in situ. Som svar på detta har vi utvecklat ett protokoll för att kvantifiera de mekaniska egenskaperna hos kycklingembryonal vävnad på ett beröringsfritt och icke-invasivt sätt. Detta uppnås genom att integrera ett konfokalt Brillouin-mikroskop med ett inkubationssystem på scenen. För att undersöka vävnadsmekanik samlas ett förkultiverat embryo in och överförs till en inkubator på scenen för ex ovo-odling . Samtidigt samlas de mekaniska bilderna av neuralplattans vävnad in av Brillouin-mikroskopet vid olika tidpunkter under utvecklingen. Detta protokoll innehåller detaljerade beskrivningar av provberedning, implementering av Brillouin-mikroskopiexperiment och efterbehandling och analys av data. Genom att följa detta protokoll kan forskare studera den mekaniska utvecklingen av embryonal vävnad under utvecklingen longitudinellt.
Introduction
Neuralrörsdefekter (NTD) är allvarliga fosterskador i det centrala nervsystemet som orsakas av fel i neuralrörsstängningen (NTC) under embryonal utveckling1. Etiologin för NTD är komplex. Studier har visat att NTC involverar en sekvens av morfogenetiska processer, inklusive konvergent förlängning, böjning av neuralplattan (t.ex. apikal sammandragning), höjning av neuralvecket och slutligen vidhäftning av neuralvecket. Dessa processer regleras av flera molekylära och genetiska mekanismer 2,3, och eventuella fel i dessa processer kan resultera i NTD 4,5,6. Eftersom allt fler bevis tyder på att mekaniska signaler också spelar avgörande roller under NTC 3,7,8,9,10,11, och relationer har hittats mellan gener och mekaniska signaler 12,13,14, blir det absolut nödvändigt att undersöka vävnadens biomekanik under neurulation.
Flera tekniker har utvecklats för att mäta de mekaniska egenskaperna hos embryonala vävnader, inklusive laserablation (LA)15, vävnadsdissektion och relaxation (TDR)16,17, mikropipettaspiration (MA)18, atomkraftsmikroskopi (AFM)-baserad nanoindentation19, mikroindenters (MI) och mikroplattor (MP)20, mikroreologi (MR) med optisk/magnetisk pincett 21,22,23 och droppbaserade sensorer24. Befintliga metoder kan mäta mekaniska egenskaper vid rumsliga upplösningar som sträcker sig från subcellulära till vävnadsskalor. De flesta av dessa metoder är dock invasiva eftersom de kräver kontakt med provet (t.ex. MA, AFM, MI och MP), injektion av externt material (t.ex. MR och droppbaserade sensorer) eller vävnadsdissektion (t.ex. LA och TDR). Som ett resultat är det utmanande för befintliga metoder att övervaka den mekaniska utvecklingen av neuralplattevävnad in situ25. Nyligen har efterklangselastografi med optisk koherens visat sig lovande för beröringsfri mekanisk kartläggning med hög rumslig upplösning26.
Konfokal Brillouin-mikroskopi är en framväxande optisk modalitet som möjliggör beröringsfri kvantifiering av vävnadsbiomekanik med subcellulär upplösning 27,28,29,30. Brillouinmikroskopi bygger på principen om spontan Brillouin-ljusspridning, vilket är interaktionen mellan det infallande laserljuset och den akustiska vågen som induceras av termiska fluktuationer i materialet. Följaktligen upplever det spridda ljuset ett frekvensskifte, känt som Brillouin-skiftet ωR, enligt ekvation31:
(1)
Här är materialets 
brytningsindex, λ är våglängden för det infallande ljuset, M' är den längsgående modulen, ρ är massdensiteten och θ är vinkeln mellan det infallande ljuset och det spridda ljuset. För samma typ av biologiska material är förhållandet mellan brytningsindex och densitet 
ungefär konstant 28,32,33,34,35,36. Således kan Brillouin-skiftet direkt användas för att uppskatta relativa mekaniska förändringar i fysiologiska processer. Genomförbarheten av Brillouin-mikroskopi har validerats i olika biologiska prover 29,37,38. Nyligen demonstrerades time-lapse mekanisk avbildning av ett levande kycklingembryo genom att kombinera ett Brillouin-mikroskop med ett inkubationssystempå scenen 39. Detta protokoll innehåller detaljerade beskrivningar av provberedning, experimentimplementering och efterbearbetning och analys av data. Vi hoppas att denna insats kommer att underlätta en utbredd användning av beröringsfri Brillouin-teknik för att studera biomekanisk reglering i embryoutveckling och fosterskador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Wayne State University.
1. Experimentell förberedelse
- Använd en 70 % etanollösning för att rengöra och sterilisera saxen och pincetten. Förbered också engångspipetter och en spruta.
- Förbered ett tvättmedium genom att tillsätta 3.595 g NaCl till 495 ml avjoniserat vatten. Tillsätt sedan 5 ml penicillin-streptomycin (5 E/ml) till mediet. Fyll en 100 mm petriskål med diskmediet och värm den till 37 °C.
- Tillaga odlingsskålar enligt figur 1, som illustrerar den övergripande konfigurationen.
- Förbered en bit filterpapper, skär den i en rektangulär form på cirka 17 mm × 20 mm och ta bort de fyra hörnen. Skapa en ihålig mittpunkt i filterpapperet, cirka 7 mm × 10 mm stor för att säkra embryot (figur 1, vänster).
OBS: Samlingen av embryon beskrivs i steg 2. - Fäst en kommersiellt tillgänglig ring (Φ = 1 tum, se materialtabell) med ett flexibelt filmskikt (dvs. paraffinfilm), och se till att den flexibla filmen också har en ihålig mitt. Denna ring med filmen kommer att användas för att hålla filterpapperet med embryot.
- Placera slutligen den förberedda ringen i en 35 mm petriskål (Figur 1, höger).
OBS: Filterpapperet är till för att säkra och hålla det extraherade embryot genom att placera filterpapperet på membranet och lämna embryot i mitten ihåligt område (vilket kommer att beskrivas i steg 2). De fyra hörnen kapades för att passa storleken på den yttre ringen (inte nödvändigt om den redan är monterad). En 35 mm odlingsskål med glasbotten används för bättre laserstråleutbredning. Skålen har en inre brunn (Φ = 23 mm), som kan fyllas med äggvita för ex ovo-odling . Ringens diameter måste vara större än diametern på den inre brunnen så att brunnen kan täckas av den flexibla filmen på ringen (Figur 1, infälld). Storleken på filterpapperet är inte begränsad och kan modifieras beroende på storleken på den valda ringen och odlingsskålen. Alternativt kan skålens botten förbeläggas med ett agarosskikt (tjocklek: ~1 mm). Genom att ta bort agaros från mitten av skiktet med hjälp av ett blad kan en brunn med liknande form som den ihåliga mitten av den flexibla filmen skapas för laddning av äggvita. En kritisk punkt är att de fyra sidorna av det ihåliga filterpapperet måste ha tillräcklig bredd (> 5 mm) för att säkerställa att embryot sitter fast.
- Förbered en bit filterpapper, skär den i en rektangulär form på cirka 17 mm × 20 mm och ta bort de fyra hörnen. Skapa en ihålig mittpunkt i filterpapperet, cirka 7 mm × 10 mm stor för att säkra embryot (figur 1, vänster).
2. Extraktion och ex ovo-odling av kycklingembryot
OBS: Detta steg är modifierat från tidigare publicerade rapporter40,41.
- Efter förodlingen tar du upp ägget från inkubatorn och placerar det på sin långa axel på äggkartongbrickan. Rengör äggskalet med 70 % etanol, se till att täcka hela ytan och låt det sedan vila i 15 minuter.
- Håll ägget på sin korta axel och knäck det i botten. Öppna ägget över en ren petriskål på 100 mm för att extrahera innehållet, som visas i figur 2. Se till att inte rotera ägget medan du håller och knäcker det.
- Använd en pipett, överför och samla upp cirka 10 ml av den tunna äggvitan (dvs. den flytande äggvitan42) i ett 15 ml rör för användning ex ovo-odling . Fyll odlingsformens mittbrunn med den uppsamlade tunna äggvitan (ca 0,9 ml), som visas i figur 3. Påfyllningsprocessen bör vara långsam och undvika att det bildas bubblor inuti brunnen. Se till att odlingsskålen med äggvita värms upp till 37 °C.
OBS: Denna maträtt kommer att användas för att odla embryot ex ovo. Nya odlingsskålar fyllda med diskmedium kommer att användas under Brillouin-avbildningen (se steg 3). - Använd silkespapper för att försiktigt ta bort det tjocka äggvitetyget (dvs. trögflytande äggvita) som sitter fast på embryot genom att försiktigt separera äggvitebandet från vitellinmembranet, som visas i figur 4. Undvik direktkontakt med vitellinmembranet.
- Efter att ha tagit bort all tjock äggvita, fäst försiktigt filterpapperet på vitellinmembranet. Se till att embryots kroppsaxel är i linje med den långa axeln på mittrektangeln på filterpapperet. Använd en sax för att klippa av membranet som omger filterpapperet.
- Använd en pincett och dra försiktigt bort det isolerade filterpapperet från äggulan i en sned riktning. Vänd filterpapperet upp och ner för att placera embryot med ryggsidan nedåt (för inverterad mikroskopkonfiguration). Sänk försiktigt ner hela filterpapperet från ena sidan av den långa axeln i 100 mm petriskålen med diskmediet på ett snett sätt.
- Tvätta bort eventuell kvarvarande äggula genom att försiktigt spraya tvättmediet parallellt med filterpapperet med en ren pipett. Undvik att spraya tvättmediet direkt på membranet.
- Efter att ha rensat bort all äggula, ta försiktigt bort filterpapperet från tvättmediet och använd silkespapper för att absorbera eventuellt överflödigt medium från kanterna. Placera sedan filterpappret med embryot på odlingsskålen och se till att embryots ryggsida är vänd nedåt, som illustreras i figur 5. För att bibehålla luftfuktigheten, lägg ett fuktat silkespapper i skålen.
- Överför odlingsskålen till inkubatorn på scenen för ex ovo-odling .
3. Brillouin-mätning av embryot
- Förbered ytterligare en uppsättning kulturskålar och fyll dem med diskmedel. Se till att tvättmediet är uppvärmt till 37 °C.
- När embryot når önskat utvecklingsstadium, överför filterpappret med embryot till odlingsskålen fylld med tvättmedium. Placera odlingsskålen i Brillouin-mikroskopets inkubator på scenen (se materialtabell).
- Innan du utför Brillouin-mätningen, spara en ljusfältsbild av hela embryot som referens. Den detaljerade konfigurationen av Brillouin-mikroskopet har tidigare beskrivits30 och sammanfattas i avsnittet Resultat (figur 6).
- Mät Brillouin-signalen för vatten och metanol, som kommer att användas i steg 4 för kalibreringsprocessen.
- Justera kamerans exponeringstid för infallande lasereffekt och elektronmultiplicerande laddningskopplad enhet (EMCCD, se materialtabell) för att uppnå minst 10 000 räkningar av Brillouin-signalen. Använd ljusfältsbilden som vägledning för att ställa in skanningsintervall och stegstorlek. Få en Brillouin-bild av det intressanta området genom att skanna embryot med hjälp av ett 2D-translationssteg.
OBS: Det horisontella skanningsområdet kan bestämmas baserat på ljusfältsbilden, och det vertikala (dvs. djup) skanningsområdet kan bestämmas baserat på signalstyrkan som erhålls från en snabb och grov skanning. För att förhindra fotoskador på embryot, begränsa den infallande effekten till 25 mW och ställ in exponeringstiden för EMCCD-kameran på 50 ms. Välj en stegstorlek på 2 μm i horisontell riktning och 1 μm i vertikal riktning för att balansera bildkvalitet och exponeringstid. - När skanningen är klar, ta försiktigt bort filterpappret med embryot och använd silkespapper för att absorbera eventuellt överflödigt tvättmedel. Sätt sedan tillbaka filterpappret i odlingsskålen fylld med tunn äggvita för kontinuerlig odling i inkubatorn på stage.
- Upprepa steg 3.2-3.5 med jämna tidsintervall (t.ex. 1.5 timmar) för att ta time-lapse Brillouin-bilder när embryot utvecklas.
- Rekonstruera 2D Brillouin-bilden genom att följa steg 4.
4. Rekonstruktion av Brillouin-bilder
- Kalibrera Brillouin-spektrometern med Brillouin-signaler av vatten och metanol för att beräkna det fria spektralområdet (FSR) och pixel-till-frekvensomvandlingsförhållandet (PR) för spektrometern30. De kalibrerade värdena för FSR och PR kommer att användas för att beräkna Brillouin-förskjutningen av embryot vid varje pixel.
OBS: Figur 7A visar ett rått Brillouin-spektrum som fångats av EMCCD-kameran. Genom att vertikalt summera spektrumet och sedan göra en Lorentzian-anpassning kan toppavståndet Δd för de två punkterna erhållas (figur 7B). Genom att få toppavståndet för vatten Δdvatten och metanol Δdmetanol kan FSR och PR beräknas baserat på ekvationerna30: PR = 2· (ωmetanol-ω vatten)/(Δdvatten- Δdmetanol), och FSR = 2·ωvatten + PR·Δdvatten, med den kända Brillouin-förskjutningen av vatten ωvatten = 6,01 GHz och metanol ωmetanol = 4,49 GHz vid 660 nm. - Erhåll det maximala avståndet för Brillouin-signalen vid varje pixel i samplingen. Beräkna Brillouin-skiftet baserat på den kalibrerade FSR och PR:ω-prov = 0,5 (FSR - PR xΔd-prov)30, därω-provet är Brillouin-förskjutningen för provet ochΔd-provet är toppavståndet för Brillouin-signalen.
- Rekonstruera Brillouin-bilden i 2D baserat på Brillouin-förskjutningarna för alla pixlar.
OBS: För att utföra lokal analys kan man välja ett område av intresse (t.ex. neuralplattan) från den erhållna Brillouin-bilden och kvantifiera dess mekaniska egenskaper. Ett vanligt tillvägagångssätt är att beräkna den genomsnittliga Brillouin-förskjutningen i den valda regionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 visar schemat för Brillouin-mikroskopet. Systemet använder en 660 nm laser som ljuskälla. En isolator placeras direkt efter laserhuvudet för att avvisa eventuellt bakåtreflekterat ljus, och ett filter med neutral densitet (ND) används för att justera lasereffekten. Ett par linser, L1 och L2, med brännvidder på f1 = 16 mm respektive f2 = 100 mm, används för att expandera laserstrålen. En halvvågsplatta (HWP) och en linjär polarisator (polarisator 1) används för att justera strålens effekt som lyser på antingen provet eller kalibreringsmaterialen (dvs. vatten och metanol) efter den polariserade stråldelaren (PBS). För att fokusera lasern i provet och samla in bakåtspritt ljus används en objektivlins (OBJ2) med en numerisk bländare (NA) på 0,6 och en förstoring på 40. Det infallande ljuset och det bakåtriktade spridda ljuset separeras av samma PBS efter polarisationsjustering med hjälp av en kvartsvågsplatta (QWP2). På samma sätt används OBJ1 och QWP1 för att styra laserstrålen till kalibreringsmaterialen. Brillouin-signalen levereras av en single-mode-fiber till en Brillouin-spektrometer43 för analys. Inuti spektrometern kopplar en cylindrisk lins (C1) Brillouin-signalen till den första VIPA-etalonen (virtually imaged phased array). Utsignalen från den första VIPA-etalon omformas av en annan cylindrisk lins (C2) och fokuseras på mask 1 för att avvisa icke-spritt laserljus. Sedan kopplas Brillouin-signalen till en andra VIPA-etalon av en sfärisk lins (SL1), omformas av en annan sfärisk lins (SL2) och projiceras på mask 2. Det resulterande spektralmönstret går sedan genom en 4-f-enhet för brusavvisning och projiceras på en EMCCD för inspelning. Vi använde en kommersiell mikroskopkropp (se materialförteckning). I allmänhet kan vilken mikroskopkropp som helst med olika märken användas så länge den har en tillgänglig port för att leverera den externa ljusstrålen. Inkubatorn på scenen är en metallkammare med temperatur-, gas- och luftflödeskontroll. Provets position justeras via det 2D-motoriserade steget. En komplementär metalloxidhalvledarkamera (CMOS) används för att ta ljusfältsbilden.
Figur 8 visar time-lapse ljusfält och Brillouin-bilder av ett representativt kycklingembryo. Embryot extraherades efter 29 timmars in-ovo-odling, och bilderna togs vid 29 timmar, 30,5 timmar och 32 timmar med ex ovo-odling, vilket motsvarar somittalen 4, 5 respektive84. I allmänhet kan embryot odlas i inkubatorn på scenen i minst 24 timmar. Den röda linjen i ljusfältsbilden anger platsen för Brillouin-avbildning. Med hjälp av de erhållna Brillouin-bilderna valdes neuralplattans region (markerad med den svarta streckade linjen i figur 8) och beräknade den genomsnittliga Brillouin-förskjutningen för denna region. Som visas i figur 9 ökar den genomsnittliga Brillouin-förskjutningen av vävnaden under neuralrörsstängning. Den longitudinella modulen beräknas också baserat på ekvation (1), där värdet = 1,3330 uppskattas från litteratur med zebrafiskembryon45, förutsatt att värdet är relativt konstant för liknande typer av biologiska vävnader 28,33.
Figur 1: Schematisk bild av hela odlingsskålens konfiguration för embryonal utveckling. Bilden visar ett filterpapper för att fästa embryot till vänster och en 35 mm odlingsskål med en ring fäst med ett flexibelt filmskikt till höger. Tvärsnittsschemat finns också. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Processen att öppna äggskalet ovanför en ren 100 mm petriskål för att extrahera ägget i skålen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fyllning av odlingsskålens mittbrunn med tunn äggvita. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Dra bort den tjocka äggvitan i den riktning som anges av den röda pilen med hjälp av en bit silkespapper. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Placering av filtrerpapperet i odlingsskålen med embryot på ovansidan av filtrerpapperet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Schematisk bild av Brillouin-mikroskopet. Den röda pilen indikerar laserstrålens ljusväg och den orange pilen indikerar ljusvägen för Brillouin-signalen. L1, L2, SL1-SL4: sfärisk lins; SF: rumsligt filter; C1, C2: cylindrisk lins, HWP: halvvågsplatta; PBS: polariserad stråldelare; QWP1, QWP2: kvartsvågsplatta; OBJ1, OBJ2: Objektivlins; LP: lins par. VIPA: virtuellt avbildad fasad array. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Representativ Brillouin-signal. A) Ett representativt Brillouin-spektrum som fångas upp av ECNN. (B) Ett vertikalt summerat Brillouin-spektrum och motsvarande Lorentzianskt anpassningsresultat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Ljusfältsbilder och motsvarande Brillouin-tvärsnittsbilder av embryot vid 29 timmar, 30,5 timmar och 32 timmar med 4, 5 och 8 somiter. Röda heldragna linjer anger platsen för Brillouin-avbildning, och den svarta prickade linjen indikerar neuralplattans region. Det grå området i 32 timmars (8 somiter) bilden är en artefakt av kurvanpassning på grund av den svaga Brillouin-signalen och utesluts vid beräkning av medelskiftet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Brillouinförskjutning och den uppskattade longitudinella modulen för neuralplattan mot somitantal och inkubationstid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embryots tidiga utveckling kan lätt påverkas av yttre störningar. Därför krävs största försiktighet under extraktionen och överföringen av provet. Ett potentiellt problem är att embryot lossnar från filterpapperet, vilket kan leda till att vitellinmembranet krymper och resulterar i en lutande artefakt av neuralplattan vid Brillouin-avbildning. Dessutom kan denna krympning stoppa embryots utveckling. Uppmärksamhet bör ägnas åt flera kritiska steg för att förhindra lossning. För det första, i steg 2.4, är det avgörande att säkerställa ett noggrant avlägsnande av äggvitan från membranytan. Eventuell kvarvarande äggvita kan hindra membranets vidhäftning till filterpapperet46,47. Dessutom är det viktigt att spraya tvättmediet i en riktning som är parallell med membranet under tvättprocessen. Att direkt träffa membranet med vätskeflödet kan orsaka att membranet lossnar eller till och med slits sönder. Dessutom bör hela tvättprocessen slutföras inom en kort tid (t.ex. <3 minuter), eftersom långvarig nedsänkning också kan leda till att embryot lossnar från filterpapperet.
Innan du utför Brillouin-mätningar är det nödvändigt att överföra embryot till en skål med tvättmedium. Detta beror på att Brillouin-förskjutningen av äggvitan ligger mycket nära nervplattornas vävnader, vilket orsakar dålig bildkontrast. Brillouin-avbildning erhålls genom punktskanning, vilket kan vara tidskrävande, särskilt när det handlar om många punkter. I detta protokoll är skanningsområdet cirka 400 μm horisontellt och mindre än 100 μm vertikalt. För att undvika störningar i embryots utveckling begränsades den totala exponeringstiden till inom 30 minuter. Detta uppnås genom att använda en stegstorlek på 2 μm horisontellt och 1 μm vertikalt. Om man bara är intresserad av den genomsnittliga Brillouin-förskjutningen i en specifik region kan en snabb och grov skanning (t.ex. med en stegstorlek på 4 μm både horisontellt och vertikalt) genomföras, vilket tar mindre än 5 minuter och kan mildra den negativa effekten på embryoutvecklingen.
Brillouin-mikroskopi erbjuder en icke-invasiv avbildningsmetod i realtid för att undersöka biomekaniken i embryoutvecklingen. En begränsning med denna metod ligger i dess penetrationsdjup, som är cirka 100-200 μm beroende på embryots utvecklingsstadium. En ökning av lasereffekten och/eller exponeringstiden för EMCCD kan delvis lösa detta problem, men det sker på bekostnad av potentiell fototoxicitet och/eller en lång exponeringstid. Alternativt kan befintlig optisk teknik, t.ex. adaptiv optik, användas för att förbättra penetrationsdjupet48.
Sammanfattningsvis har vi etablerat ett protokoll för att undersöka de mekaniska egenskaperna hos levande kycklingembryon med hjälp av Brillouin-mikroskopi. Denna beröringsfria metod kan uppfylla nuvarande ouppfyllda behov och är ett komplement till andra befintliga verktyg för att studera biomekanik i embryonal utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Fisherbrand | FB0875713 | |
| 2D motorized stage | Prior Scientific | H117E2 | |
| 35 mm Petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Brillouin Microscope with on-stage incubator | N/A | N/A | This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30 |
| Chicken eggs | University of Connecticut | N/A | |
| CMOS camera | Thorlabs | CS2100M-USB | |
| EMCCD camera | Andor | iXon | |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | #2701 | |
| Filter paper | Whatman | 1004-070 | |
| Incubator for in ovo culture | GQF Manufacturing Company Inc. | GQF 1502 | |
| Ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Microscope body | Olympus | IX73 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| On-stage incubator | Oko labs | OKO-H301-PRIOR-H117 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-711-6M | |
| Scissors | Artman instruments | N/A | 3pc Micro Scissors 5 |
| Syringe | BD | 305482 | |
| Tissue paper | Kimwipes | N/A | |
| Tube | Corning | 430052 | |
| Tweezers | DR Instruments | N/A | Microdissection Forceps Set |
References
- Greene, N. D. E., Copp, A. J.
- Suzuki, M., Morita, H., Ueno, N. Molecular mechanisms of cell shape changes that contribute to vertebrate neural tube closure. Development, Growth & Differentiation. 54 (3), 266-276 (2012).
- Nikolopoulou, E., Galea, G. L., Rolo, A., Greene, N. D. E., Copp, A. J. Neural tube closure: Cellular, molecular and biomechanical mechanisms. Development. 144 (4), 552-566 (2017).
- Juriloff, D. M., Harris, M. J. Mouse models for neural tube closure defects. Human Molecular Genetics. 9 (6), 993-1000 (2000).
- Copp, A. J., Greene, N. D. E. Genetics and development of neural tube defects. The Journal of Pathology: A Journal of the Pathological Society of Great Britain and Ireland. 220 (2), 217-230 (2010).
- Wang, M., De Marco, P., Capra, V., Kibar, Z. Update on the role of the non-canonical wnt/planar cell polarity pathway in neural tube defects. Cells. 8 (10), 1198 (2019).
- Galea, G. L., et al. Biomechanical coupling facilitates spinal neural tube closure in mouse embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26), E5177-E5186 (2017).
- Moon, L. D., Xiong, F.
- Christodoulou, N., Skourides, P. A. Distinct spatiotemporal contribution of morphogenetic events and mechanical tissue coupling during xenopus neural tube closure. Development. 149 (13), (2022).
- De Goederen, V., Vetter, R., Mcdole, K., Iber, D. Hinge point emergence in mammalian spinal neurulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2117075119 (2022).
- Christodoulou, N., Skourides, P. A. Somitic mesoderm morphogenesis is necessary for neural tube closure during xenopus development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1091629 (2023).
- Nikolopoulou, E., et al. Spinal neural tube closure depends on regulation of surface ectoderm identity and biomechanics by grhl2. Nature Communications. 10 (1), 2487 (2019).
- Nychyk, O., et al. Vangl2-environment interaction causes severe neural tube defects, without abnormal neuroepithelial convergent extension. Disease Models & Mechanisms. 15 (1), 049194 (2022).
- Li, B., Brusman, L., Dahlka, J., Niswander, L. A. Tmem132a ensures mouse caudal neural tube closure and regulates integrin-based mesodermal migration. Development. 149 (17), (2022).
- Zulueta-Coarasa, T., Fernandez-Gonzalez, R. Laser ablation to investigate cell and tissue mechanics in vivo. Integrative Mechanobiology: Micro-and Nano Techniques in Cell Mechanobiology. , Cambridge University Press. 128-147 (2015).
- Wiebe, C., Brodland, G. W. Tensile properties of embryonic epithelia measured using a novel instrument. Journal of Biomechanics. 38 (10), 2087-2094 (2005).
- Luu, O., David, R., Ninomiya, H., Winklbauer, R. Large-scale mechanical properties of xenopus embryonic epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (10), 4000-4005 (2011).
- Maître, J. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nature Cell Biology. 10 (4), 429-436 (2008).
- Zamir, E. A., Srinivasan, V., Perucchio, R., Taber, L. A. Mechanical asymmetry in the embryonic chick heart during looping. Annals of Biomedical Engineering. 31, 1327-1336 (2003).
- Bambardekar, K., Clément, R., Blanc, O., Chardès, C., Lenne, P. F. Direct laser manipulation reveals the mechanics of cell contacts in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (5), 1416-1421 (2015).
- Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476 (7358), 57-62 (2011).
- Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nature Cell Biology. 17 (4), 470-479 (2015).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nature Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
- Campàs, O. A toolbox to explore the mechanics of living embryonic tissues. Seminars in Cell & Developmental Biology. 55, 119-130 (2016).
- Christian, Z. D., et al. High-resolution 3D biomechanical mapping of embryos with reverberant optical coherence elastography (Rev-OCE). Proceedings of SPIE. , 123670 (2023).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. J. N. P. Confocal brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nature Photonics. 1 (1), 39-43 (2008).
- Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by brillouin microscopy. Nature Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
- Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: An emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
- Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on brillouin module to confocal microscopes. Nature Protocols. 16 (2), 1251-1275 (2021).
- Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic press. (2020).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by brillouin optical microscopy. Biophysical Journal. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Scarcelli, G., Pineda, R., Yun, S. H. Brillouin optical microscopy for corneal biomechanics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 185-190 (2012).
- Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive brillouin microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 37217 (2016).
- Zhang, J., et al. Tissue biomechanics during cranial neural tube closure measured by brillouin microscopy and optical coherence tomography. Birth Defects Research. 111 (14), 991-998 (2019).
- Zhang, J., et al. Nuclear mechanics within intact cells is regulated by cytoskeletal network and internal nanostructures. Small. 16 (18), 1907688 (2020).
- Elsayad, K., Polakova, S., Gregan, J. Probing mechanical properties in biology using brillouin microscopy. Trends in Cell Biology. 29 (8), 608-611 (2019).
- Poon, C., Chou, J., Cortie, M., Kabakova, I. Brillouin imaging for studies of micromechanics in biology and biomedicine: From current state-of-the-art to future clinical translation. Journal of Physics: Photonics. 3 (1), 012002 (2020).
- Handler, C., Scarcelli, G., Zhang, J. Time-lapse mechanical imaging of neural tube closure in live embryo using brillouin microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 263 (2023).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 220 (3), 284-289 (2001).
- Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e54636 (2016).
- Nys, Y., Guyot, N. Improving the safety and quality of eggs and egg products, vol 1: Egg chemistry, production and consumption. Nys, Y., Bain, M., VanImmerseel, F. , 83-132 (2011).
- Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-ghz spectrometer for brillouin scattering analysis. Journal of Visualized Experiments. (106), e53468 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
- Williams, R. M., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
- Edrei, E., Scarcelli, G. Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications. Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).
