Summary
このプロトコルは、ニワトリ胚の神経形成中の神経板組織の機械的特性を縦断的に監視するために開発されました。これは、ブリルアン顕微鏡とステージ上のインキュベーションシステムの統合に基づいており、 卵子 培養されたニワトリ胚の神経板組織のライブ機械的イメージングを可能にします。
Abstract
神経管閉鎖(NTC)は、胚発生における重要なプロセスです。このプロセスの失敗は、神経管の欠損につながり、先天性奇形や死亡率を引き起こす可能性があります。NTCには、遺伝的、分子的、機械的レベルの一連のメカニズムが関与しています。近年、機械的制御はますます魅力的なトピックになっていますが、3D胚組織の機械的試験を その場で実施するための適切な技術が不足しているため、ほとんど未開拓のままです。これに対応して、私たちは、ニワトリ胚組織の機械的特性を非接触および非侵襲的な方法で定量化するためのプロトコルを開発しました。これは、共焦点ブリルアン顕微鏡とステージ上のインキュベーションシステムを統合することで実現されます。組織の力学を調べるために、事前に培養された胚を採取し、ステージ上のインキュベーターに移して ex ovo 培養を行います。同時に、神経板組織の機械的画像は、発生中のさまざまな時点でブリルアン顕微鏡によって取得されます。このプロトコルには、サンプル調製、ブリルアン顕微鏡実験の実施、およびデータの後処理と分析の詳細な説明が含まれています。このプロトコルに従うことで、研究者は発生中の胚組織の機械的進化を縦断的に研究することができます。
Introduction
神経管欠損症(NTD)は、胚発生中の神経管閉鎖(NTC)の障害によって引き起こされる中枢神経系の重篤な先天性欠損症です1。NTDsの病因は複雑です。研究によると、NTCには、収束伸長、神経板の曲げ(例えば、頂端収縮)、神経襞の上昇、そして最後に神経襞の接着を含む一連の形態形成プロセスが含まれます。これらのプロセスは、複数の分子的および遺伝的メカニズムによって制御されており2,3、これらのプロセスに異常が生じると、NTDs4,5,6が発生する可能性があります。NTC 3,7,8,9,10,11の間、機械的な手がかりも重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が増えており、遺伝子と機械的な手がかり12,13,14の間に関係が見出されているため、神経形成中の組織バイオメカニクスを調査することが不可欠になります。
胚組織の機械的特性を測定するために、レーザーアブレーション(LA)15、組織解剖および弛緩(TDR)16,17、マイクロピペット吸引(MA)18、原子間力顕微鏡(AFM)ベースのナノインデンテーション19、マイクロインデンター(MI)およびマイクロプレート(MP)20、光/磁気ピンセットによるマイクロレオロジー(MR)21,22,23など、いくつかの技術が開発されています、及び液滴ベースのセンサ24。既存の方法では、細胞内スケールから組織スケールまでの空間分解能で機械的特性を測定できます。しかし、これらの方法のほとんどは、サンプルとの接触(MA、AFM、MI、MPなど)、外部材料注入(MRや液滴ベースのセンサーなど)、または組織解剖(LAやTDRなど)を必要とするため、侵襲的です。その結果、既存の方法では、神経板組織の機械的進化をin situでモニターすることは困難である25。最近、残響光コヒーレンスエラストグラフィは、高い空間分解能を持つ非接触メカニカルマッピングに有望であることが示されている26。
共焦点ブリルアン顕微鏡は、細胞内分解能27,28,29,30で組織バイオメカニクスの非接触定量を可能にする新しい光学モダリティです。ブリルアン顕微鏡は、入射レーザー光と材料内の熱揺らぎによって引き起こされる音波との相互作用である自発的ブリルアン光散乱の原理に基づいています。その結果、散乱光は、式31に従って、ブリルアンシフトωRとして知られる周波数シフトを経験します。
(1)
ここで、 
は材料の屈折率、 λ は入射光の波長、 M'は縦弾性率、 ρ は質量密度、 θ は入射光と散乱光との角度です。同じ種類の生体材料の場合、屈折率と密度
の比率はほぼ一定です28、32、33、34、35、36。したがって、ブリルアンシフトは、生理学的プロセスにおける相対的な機械的変化を推定するために直接使用できます。ブリルアン顕微鏡の実現可能性は、さまざまな生物学的サンプルで検証されています29,37,38。最近、生きたニワトリ胚のタイムラプス機械的イメージングが、ブリルアン顕微鏡とステージ上のインキュベーションシステム39との組み合わせによって実証された。このプロトコルでは、サンプル調製、実験の実施、およびデータの後処理と分析について詳しく説明します。この取り組みにより、胚発生や先天性欠損症の生体力学的調節を研究するための非接触ブリルアン技術の普及が促進されることを願っています。
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Protocol
このプロトコルは、ウェイン州立大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されています。
1. 実験準備
- 70%エタノール溶液を使用して、はさみとピンセットを洗浄および滅菌します。また、使い捨てピペットと注射器を用意してください。
- 495 mLの脱イオン水に3.595 gのNaClを添加して洗浄培地を調製します。次に、5 mlのペニシリン-ストレプトマイシン(5 U / mL)を培地に加えます。100mmのシャーレに洗浄液を入れ、37°Cに温めます。
- 全体の構成を示す 図1に従って培養皿を調製する。
- ろ紙を用意し、約17mm×20mmの長方形に切り、四隅を取り除きます。胚を固定するために、約7mm×10mmの大きさのろ紙の中心を中空にします(図1、左)。
注:胚の収集については、ステップ2で説明します。 - 市販のリング(Φ = 1インチ、 材料表を参照)をフレキシブルフィルム(すなわち、パラフィンフィルム)層で取り付け、フレキシブルフィルムの中心も中空になるようにします。フィルム付きのこのリングは、胚の入った濾紙を保持するために使用されます。
- 最後に、準備したリングを35mmのシャーレに入れます(図1、右)。
注:濾紙は、濾紙を膜の上に置き、胚を中央の空洞領域に残すことにより、抽出された胚を固定および保持するためのものです(手順2で詳しく説明します)。四隅は、外側のリングのサイズに合うようにカットされています(すでに取り付けられている場合は不要)。35mmのガラス底培養皿を使用して、レーザービームの伝搬を改善します。皿には内側のウェル(Φ = 23 mm)があり、卵白で満たして 卵 白を培養することができます。リングの直径は、ウェルがリング上の柔軟なフィルムで覆われるように、内側のウェルの直径よりも大きくする必要があります(図1、挿入図)。濾紙のサイズに制限はなく、選択したリングと培養皿のサイズに応じて変更できます。あるいは、皿の底にアガロース層(厚さ:~1mm)をあらかじめコーティングすることもできます。ブレードを用いて層の中心からアガロースを除去することにより、可撓性フィルムの中空中心と同様の形状のウェルを卵白に充填することができる。重要な点の1つは、中空ろ紙の4つの側面が、胚の付着を確実にするために十分な幅(>5 mm)を持っている必要があることです。
- ろ紙を用意し、約17mm×20mmの長方形に切り、四隅を取り除きます。胚を固定するために、約7mm×10mmの大きさのろ紙の中心を中空にします(図1、左)。
2. ニワトリ胚の抽出と 卵子 培養
注:この手順は、以前に公開されたレポート40、41から変更されています。
- 前培養後、インキュベーターから卵を取り出し、卵パックトレイの長軸上に置きます。卵殻を70%エタノールで洗浄し、表面全体を覆うようにしてから、15分間休ませます。
- 卵を短軸で持ち、底を割る。 図2に示すように、清潔な100mmのペトリ皿で卵を開き、中身を取り出します。卵を持って割っている間は、卵を回転させないように注意してください。
- ピペットを使用して、約10 mLの薄い卵白(すなわち、液体卵白42)を15 mLのチューブに移し、回収し、 ex ovo 培養用とする。 図3に示すように、培養皿の中央ウェルに、採取した薄い卵白(約0.9 mL)を充填します。充填プロセスは、ウェル内の気泡の形成を避けて、ゆっくりと行う必要があります。卵白入り培養皿が37°Cに温められていることを確認してください。
注:この皿は、胚 ex ovoの培養に使用されます。洗浄培地で満たされた新しい培養皿は、ブリルアンイメージング中に使用されます(ステップ3を参照)。 - ティッシュペーパーを使用して、 図4に示すように、卵白を硝子体膜から慎重に分離することにより、胚に付着した厚い卵白(すなわち、粘性のある卵白)を静かに取り除きます。ビテリン膜との直接接触を避けてください。
- 厚い卵白をすべて取り除いた後、濾紙をビテリンメンブレンに慎重に貼り付けます。胚の体軸がろ紙の中央の長方形の長軸と揃っていることを確認します。はさみを使用して、ろ紙を囲む膜を切断します。
- ピンセットを使用して、分離されたろ紙を卵黄から斜めにそっと引き離します。ろ紙を逆さまにして、胚の背側を下にして配置します(倒立顕微鏡構成の場合)。濾紙全体を長軸の片側から、洗浄媒体を入れた100mmシャーレに斜めに慎重に浸します。
- 清潔なピペットを使用して、濾紙と平行に洗浄媒体を静かにスプレーして、残っている卵黄を洗い流します。洗浄媒体をメンブレンに直接スプレーすることは避けてください。
- 卵黄をすべて取り除いた後、濾紙を洗浄媒体から慎重に取り出し、ティッシュペーパーを使用して端から余分な媒体を吸収します。次に、 図5に示すように、胚の入った濾紙を培養皿に置き、胚の背側が下を向くようにします。湿度を保つために、湿らせたティッシュペーパーを皿に入れます。
- 培養皿をステージ上のインキュベーターに移し、 ex ovo 培養を行います。
3.胚のブリルアン測定
- 別の培養皿を準備し、それらを洗浄培地で満たします。洗浄媒体が37°Cに温められていることを確認します。
- 胚が所望の発育段階に達したら、胚の入った濾紙を洗浄培地で満たされた培養皿に移します。培養皿をブリルアン顕微鏡のステージ上のインキュベーターに入れます( 材料表を参照)。
- ブリルアン測定を行う前に、参照用に胚全体の明視野画像を保存します。ブリルアン顕微鏡の詳細な構成は、以前に説明されており30 、結果セクション(図6)に要約されている。
- 水とメタノールのブリルアン信号を測定し、ステップ4の校正プロセスで使用します。
- 入射レーザー出力と電子増倍電荷結合素子(EMCCD、 材料表を参照)カメラの露光時間を調整して、少なくとも10,000カウントのブリルアン信号を達成します。明視野画像をガイドとして使用して、スキャン範囲とステップサイズを設定します。2Dトランスレーショナルステージを使用して胚をスキャンし、関心領域のブリルアン画像を取得します。
注:水平方向のスキャン範囲は明視野画像に基づいて決定でき、垂直方向(つまり、深さ)のスキャン範囲は、高速および粗いスキャンから得られた信号強度に基づいて決定できます。胚への光損傷を防ぐには、入射電力を25mWに制限し、EMCCDカメラの露光時間を50msに設定します。水平方向に2μm、垂直方向に1μmのステップサイズを選択し、イメージング品質と取得時間のバランスを取ります。 - スキャンが完了したら、胚の入った濾紙を慎重に取り除き、ティッシュペーパーを使用して余分な洗浄媒体を吸収します。次に、濾紙を薄い卵白で満たされた培養皿に戻し、ステージ上のインキュベーターで連続培養します。
- 手順3.2〜3.5を一定の時間間隔(例:1.5時間)で繰り返して、胚の発育に合わせてタイムラプスブリルアン画像をキャプチャします。
- 手順 4 に従って 2D ブリルアン イメージを再構成します。
4. ブリルアン像の再構築
- 水とメタノールのブリルアン信号を用いてブリルアン分光計を較正し、分光器30の自由スペクトル範囲(FSR)およびピクセル対周波数変換比(PR)を計算する。FSR と PR のキャリブレーションされた値を使用して、各ピクセルでの胚のブリルアン シフトを計算します。
メモ: 図7A は、EMCCDカメラで撮影された生のブリルアンスペクトルを示しています。スペクトルを垂直に合計し、ローレンツフィッティングを行うことで、2つのドットのピーク距離Δdを得ることができます(図7B)。水Δd水 とメタノールΔdメタノールのピーク距離を求めることにより、FSRとPRは式30に基づいて計算できます:PR = 2·(ωメタノール-ω水)/(Δd水-Δdメタノール)、およびFSR=2・ω水+PR・Δd水で、660nmで水ω水 =6.01GHzおよびメタノールωメタノール =4.49GHzの既知のブリルアンシフトを有する。 - サンプルの各ピクセルにおけるブリルアン信号のピーク距離を取得します。較正されたFSRとPRに基づいてブリルアンシフトを計算します:ωサンプル = 0.5(FSR - PR x Δdサンプル)30、ここでωサンプル はサンプルのブリルアンシフト、Δdサンプル はブリルアン信号のピーク距離です。
- すべてのピクセルのブリルアン シフトに基づいて 2 次元ブリルアン イメージを再構成します。
注:局所分析を行うには、取得したブリルアン画像から関心領域(神経板など)を選択し、その機械的特性を定量化します。一般的なアプローチは、選択した領域の平均ブリルアンシフトを計算することです。
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Representative Results
図6 にブリルアン顕微鏡の概略図を示します。光源に660nmのレーザーを採用。レーザーヘッドの直後にアイソレータを配置して後方反射光を除去し、NDフィルターを使用してレーザー出力を調整します。焦点距離がそれぞれf1 = 16 mmとf2 = 100 mmのL1とL2のレンズを使用して、レーザービームを拡大します。半波長板(HWP)と直線偏光板(偏光板1)を使用して、偏光ビームスプリッター(PBS)の後にサンプルまたは校正材料(水とメタノール)のいずれかを照らすビームのパワーを調整します。レーザーを試料に集光し、後方散乱光を集光するために、開口数(NA)0.6、倍率40の対物レンズ(OBJ2)を使用します。入射光と後方散乱光は、1/4波長板(QWP2)を用いて偏光調整を行った後、同じPBSで分離されます。同様に、OBJ1とQWP1は、レーザービームを校正材料に導くために使用されます。ブリルアン信号は、分析のためにシングルモードファイバによってブリルアン分光器43 に送達される。分光器の内部では、シリンドリカルレンズ(C1)がブリルアン信号を最初のVIPA(仮想画像フェーズドアレイ)エタロンに結合します。最初のVIPAエタロンの出力は、別のシリンドリカルレンズ(C2)によって再形成され、マスク1に焦点を合わせて非散乱レーザー光を除去します。次に、ブリルアン信号は球面レンズ(SL1)によって第2のVIPAエタロンに結合され、別の球面レンズ(SL2)によって再形成され、マスク2に投影されます。得られたスペクトルパターンは、ノイズ除去のために4-fユニットを通過し、記録のためにEMCCDに投影されます。市販の顕微鏡本体を使用しました( 材料表参照)。一般に、異なるブランドの顕微鏡本体は、外部光線を送達するための利用可能なポートがある限り使用できます。ステージ上のインキュベーターは、温度、ガス、空気の流れを制御する金属製のチャンバーです。サンプルの位置は、2D電動ステージ で 調整されます。相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラを使用して、明視野画像を取得します。
図8は、代表的なニワトリ胚のタイムラプス明視野画像とブリルアン画像を示しています。胚は卵子培養で29時間後に抽出され、画像は29時間、30.5時間、および32時間にex ovo培養で撮影され、それぞれ体節数4、5、および8に相当します44。一般に、胚は、ステージ上のインキュベーターで少なくとも24時間培養することができる。明視野画像の赤い線は、ブリルアンイメージングの位置を示しています。取得したブリルアン画像を用いて、神経板領域を選択し(図8の黒い点線で強調表示)、この領域の平均ブリルアンシフトを計算しました。図9に示すように、組織の平均的なブリルアンシフトは、神経管閉鎖中に増加します。縦弾性率は、式(1)に基づいても計算され、ここで、= 1.3330の値は、ゼブラフィッシュの胚45を用いた文献から推定され、その値が類似の種類の生体組織について比較的一定であると仮定して28,33。
図1:胚発生のための培養皿全体の構成の概略図。この図は、左側に胚を貼り付けるための濾紙、右側に柔軟なフィルム層でリングを取り付けた35mmの培養皿を示しています。断面の概略図も提供されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:きれいな100mmのシャーレの上で卵の殻を開き、卵を皿に取り出すプロセス。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:培養皿の中央ウェルを薄い卵白で満たす。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:ティッシュペーパーを使用して、厚い卵白を赤い矢印で示す方向に引きずり出します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:胚を濾紙の上面に乗せた培養皿への濾紙の配置。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:ブリルアン顕微鏡の概略図。 赤い矢印はレーザービームの光路を示し、オレンジ色の矢印はブリルアン信号の光路を示します。L1、L2、SL1-SL4:球面レンズ;SF:空間フィルター。C1、C2:シリンドリカルレンズ、HWP:半波長板;PBS:偏光ビームスプリッター。QWP1、QWP2:1/4波長板;OBJ1、OBJ2:対物レンズ;LP:レンズペア。VIPA:仮想画像フェーズドアレイ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7:代表的なブリルアン信号。 (A)EMCCDによって捕捉された代表的なブリルアンスペクトル。(B)垂直に合計されたブリルアンスペクトルと対応するローレンツフィッティング結果。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図8:29時間、30.5時間、32時間における胚の明視野画像と対応するブリルアン断面画像(体節4、5、8体節)。 赤色の実線はブリルアンイメージングの位置を示し、黒色の点線は神経板領域を示す。32時間(8体節)画像の灰色の領域は、ブリルアン信号が弱いことによるカーブフィッティングのアーティファクトであり、平均シフトを計算するときに除外されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図9:体節数とインキュベーション時間に対する神経板のブリルアンシフトと推定縦弾性率。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
胚の初期発達は、外乱の影響を受けやすいです。そのため、サンプルの抽出や移送には細心の注意を払う必要があります。潜在的な問題の1つは、濾紙から胚が剥離することであり、これはビテリン膜の収縮につながり、ブリルアンイメージングの神経板の傾いたアーチファクトをもたらす可能性があります。さらに、この収縮は胚の発生を止める可能性があります。離脱を防ぐために、いくつかの重要な手順に注意を払う必要があります。まず、ステップ2.4では、膜表面から卵白を完全に除去することが重要です。卵白が残っていると、膜の濾紙46、47への適切な接着が妨げられる可能性がある。さらに、洗浄プロセス中に、膜と平行な方向に洗浄媒体を噴霧することが重要です。液体の流れをメンブレンに直接当てると、メンブレンが剥離したり、破れたりすることがあります。さらに、長時間浸漬すると胚が濾紙から剥離する可能性があるため、洗浄プロセス全体は短時間(<3分など)で完了する必要があります。
ブリルアン測定を行う前に、胚を洗浄培地の入った皿に移す必要があります。これは、卵白のブリルアンシフトが神経板組織に非常に近く、画像のコントラストが悪くなるためです。ブリルアンイメージングはポイントスキャンによって取得されますが、特に多くのポイントを扱う場合は時間がかかる場合があります。このプロトコルでは、走査領域は水平方向に約400μm、垂直方向に100μm未満である。胚の発育を妨げないために、総取得時間は30分以内に制限しました。これは、水平方向に2μm、垂直方向に1μmのステップサイズを利用することで実現されます。特定の領域の平均ブリルアンシフトのみに関心がある場合は、迅速で粗いスキャン(例えば、水平方向と垂直方向の両方で4μmのステップサイズ)を実施することができ、5分未満で完了し、胚発生への悪影響を軽減することができます。
ブリルアン顕微鏡は、胚発生のバイオメカニクスを調査するためのリアルタイムかつ非侵襲的なイメージングアプローチを提供します。この方法の1つの制限は、胚の発生段階に応じて約100〜200μmである浸透深さにあります。EMCCDのレーザー出力および/または露光時間を長くすることで、この問題に部分的に対処できますが、潜在的な光毒性および/または取得時間が長くなるという代償を伴います。或いは、補償光学などの既存の光学技術が、侵入深さ48を改善するために潜在的に採用され得る。
結論として、ブリルアン顕微鏡を使用して生きたニワトリ胚の機械的特性を調べるためのプロトコルを確立しました。この非接触法は、現在の満たされていないニーズを満たすことができ、胚発生におけるバイオメカニクスを研究するための他の既存のツールを補完します。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(K25HD097288、R21HD112663)のユーニス・ケネディ・シュライバー国立小児保健・人間発達研究所の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Petri dish | Fisherbrand | FB0875713 | |
| 2D motorized stage | Prior Scientific | H117E2 | |
| 35 mm Petri dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Brillouin Microscope with on-stage incubator | N/A | N/A | This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30 |
| Chicken eggs | University of Connecticut | N/A | |
| CMOS camera | Thorlabs | CS2100M-USB | |
| EMCCD camera | Andor | iXon | |
| Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | #2701 | |
| Filter paper | Whatman | 1004-070 | |
| Incubator for in ovo culture | GQF Manufacturing Company Inc. | GQF 1502 | |
| Ring | Thorlabs | SM1RR | |
| Microscope body | Olympus | IX73 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| On-stage incubator | Oko labs | OKO-H301-PRIOR-H117 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-711-6M | |
| Scissors | Artman instruments | N/A | 3pc Micro Scissors 5 |
| Syringe | BD | 305482 | |
| Tissue paper | Kimwipes | N/A | |
| Tube | Corning | 430052 | |
| Tweezers | DR Instruments | N/A | Microdissection Forceps Set |
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