جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic
Summary
ويشيع استخدام الديدان المعدلة وراثيا في<em> C. ايليجانس</em> البحوث. ووصف هو بروتوكول بسيطة ، لكنها فعالة ، ليعرض في الجينات المحورة باستخدام الديدان القصف biolistic مع جزيئات الذهب المطلي الحمض النووي. على الجهد المبذول والنتائج من القصف إيجابية لدى مقارنتها microinjection لتوليد حيوانات معدلة وراثيا.
Abstract
عدد المختبرات باستخدام النيماتودا تعيش حرة C. ايليجانس يشهد نموا سريعا. ويعزى الإقبال على هذا النموذج البيولوجي إلى وقت الجيل السريع والقصير العمر ، صيانة سهلة وغير مكلفة ، تسلسل الجينوم بالكامل ، ومجموعة من الموارد رني والحيوانات الطافرة. بالإضافة إلى ذلك ، تحليل جيم كشفت ايليجانس الجينوم تشابه كبير بين الديدان والفقاريات العليا ، مما يوحي بأن البحث في الديدان يمكن أن يكون إضافة هامة للدراسات التي أجريت في الفئران كليا أو الخلايا المستزرعة. إن جزءا مهما من قوة والبحوث الدودة هي القدرة على استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا لدراسة الجينات وظيفة الترجمة. يمكن خلق حيوانات معدلة وراثيا إما عن طريق microinjection من germline دودة أو من خلال استخدام القصف biolistic. القصف هو أحدث تقنية وغير مألوفة لعدد من المعامل. نحن هنا وصف بروتوكول بسيط لتوليد الديدان المعدلة وراثيا عن طريق القصف biolistic مع جزيئات الذهب باستخدام بيو راد PDS – 1000 النظام. مقارنة الحمض النووي في microinjection germline خنثى ، هذا البروتوكول لديه ميزة لا تتطلب مهارات خاصة من المشغل فيما يتعلق بتحديد تشريح دودة أو أداء microinjection. وعادة ما يتم الحصول على مزيد من خطوط المعدلة وراثيا متعددة من القصف واحدة. أيضا على النقيض من microinjection ، قصف biolistic تنتج حيوانات محورة جينيا مع كل من صفائف خارج الصبغي والجينات المحورة المتكاملة. يمكن أن القدرة على الحصول على خطوط المعدلة وراثيا متكاملة تجنب استخدام البروتوكولات مطفرة لدمج الحمض النووي الأجنبية. في الختام ، يمكن أن يكون القصف biolistic طريقة جذابة لجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا ، وخاصة بالنسبة للمحققين ليست مهتمة في الاستثمار في الوقت والجهد اللازم ليصبحوا مهرة في microinjection.
Protocol
Discussion
قصف Biolistic هي طريقة بسيطة لإدخال الحمض النووي الأجنبية إلى العديد من الكائنات الحية ، بما في ذلك جيم ايليجانس 1،5،6،7،16. لأنه يعتمد على جزيئات الذهب تشكيل معقدة مع الحمض النووي في وجود CaCl 2. الأمينات الموجبة ، مثل سبيرمدين ، وحماية الحمض النووي من تدهور nu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من جانب صناديق البذور من جامعة بيتسبرغ والمعاهد الوطنية للصحة AG028977 منحة لمؤسسة آنا ليند
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold particles | Inbio gold | BD021 | 1micron | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12143 | ||
| Spermidine | Sigma | S4139 | ||
| Protamine | Sigma | P4505 | ||
| Macrocarriers | Biorad | 165-2335 | ||
| PDS-1000/He Hepta System | Biorad | 165-2257 | ||
| Rupture disk | Biorad | 165-2330 | ||
| Nystatin | Sigma | N1638 | ||
| Streptomycin | MP | 100556 |
Riferimenti
- Evans, T. C. . Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetica. 157, 1217-1226 (2001).
- Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans. Gene. 229, 31-35 (1999).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetica. 141, 977-988 (1995).
- Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. Interacting genes in nematode dauer larva formation. Nature. 290, 668-671 (1981).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA. Gene. 183, 77-85 (1996).
- Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment. Plasmid. 62, 140-145 (2009).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R., Wood, W. B. . The nematode, Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells. Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).
- Johnston, S. A. Biolistic transformation: microbes to mice. Nature. 346, 776-777 (1990).
