Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm
Summary
Transgenik solucanlar yaygın olarak kullanılır<em> C. elegans</em> Araştırma. Açıklanan DNA kaplı altın parçacıkları ile Biyolistik bombardımanı kullanarak solucanlar transgenlerin tanıtmak için, basit ama etkili bir protokoldür. Transgenik hayvan üretimi için mikroenjeksiyon ile ilgili çaba ve bombardıman sonuçları olumlu karşılaştırın.
Abstract
Serbest yaşayan nematod C. kullanarak laboratuvarların sayısı elegans hızla büyüyor. Bu biyolojik model popülerlik hızlı bir nesil zaman ve kısa ömrü, kolay ve ucuz bakım, tam sıralı genom ve RNAi kaynaklarını ve mutant hayvanlar dizisi atfedilir. Ayrıca C, analiz elegans genom, solucan, araştırma yapılan çalışmalarda tüm fareler veya kültür hücreleri için önemli bir yardımcı olabileceğini düşündürmektedir solucanlar ve yüksek omurgalılar arasında büyük bir benzerlik ortaya koymuştur . Güçlü bir solucan araştırma ve önemli bir kısmı gen yerelleştirme ve fonksiyon çalışma transgenik hayvanlar kullanma yeteneği. Transgenik hayvanlar ya solucan germline mikroenjeksiyon yoluyla veya Biyolistik bombardımanı kullanmak suretiyle oluşturulabilir. Bombardıman yeni bir tekniktir ve laboratuarları bir dizi daha tanıdık geliyor. Burada Biyolistik Bio-Rad PDS-1000 sistemi kullanarak altın parçacıkları ile bombardımanı ile transgenik solucanlar oluşturmak için basit bir protokol açıklar. Hermafrodit germline içine DNA mikroenjeksiyon ile karşılaştırıldığında, bu protokol solucan anatomisi tanımlanması veya mikroenjeksiyon performans açısından operatör özel beceri gerektiren bir avantaja sahiptir. Ayrıca birden fazla transgenik hatları genellikle tek bir bombardıman elde edilir. Ayrıca mikroenjeksiyon aksine, Biyolistik bombardıman ekstrakromozomal diziler ve entegre transgenlerin ile transgenik hayvanlar üretir. Entegre transgenik çizgiler elde etme yeteneği, yabancı DNA'nın entegre mutajenik protokollerin kullanımını önlemek. Sonuç olarak, özellikle mikroenjeksiyon az becerikli olmak için gerekli olan zaman ve çaba yatırım ilgilenen araştırmacılar için Biyolistik bombardımanı, transgenik hayvan üretimi için cazip bir yöntem olabilir.
Protocol
Discussion
Biyolistik bombardımanı C. dahil olmak üzere, birçok organizma içine yabancı DNA tanıtmak için basit bir yöntem elegans 1,5,6,7,16. CaCl 2 varlığı DNA ile bir kompleks oluşturan altın parçacıkları dayanmaktadır. Katyonik poliaminler, böyle bir spermidin olarak, in vivo nükleaz bozulması DNA korur. Spermidin labil bir molekül olduğu için, küçük alikotları -20 ° C'de saklayın ve sağ bombardımanı gerçekleştirmeden önce çözüm için önemlidir…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Pittsburgh NIH hibe AG028977 Üniversitesi ALF tohum fonları tarafından desteklenen
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold particles | Inbio gold | BD021 | 1micron | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12143 | ||
| Spermidine | Sigma | S4139 | ||
| Protamine | Sigma | P4505 | ||
| Macrocarriers | Biorad | 165-2335 | ||
| PDS-1000/He Hepta System | Biorad | 165-2257 | ||
| Rupture disk | Biorad | 165-2330 | ||
| Nystatin | Sigma | N1638 | ||
| Streptomycin | MP | 100556 |
Riferimenti
- Evans, T. C. . Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetica. 157, 1217-1226 (2001).
- Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans. Gene. 229, 31-35 (1999).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetica. 141, 977-988 (1995).
- Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. Interacting genes in nematode dauer larva formation. Nature. 290, 668-671 (1981).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA. Gene. 183, 77-85 (1996).
- Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment. Plasmid. 62, 140-145 (2009).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R., Wood, W. B. . The nematode, Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells. Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).
- Johnston, S. A. Biolistic transformation: microbes to mice. Nature. 346, 776-777 (1990).
