Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter
Summary
Jonströmmen av BK-kanaler spelas in med den teknik patch clamp. BK kanaler uttrycks i<em> Xenopus oocyter</em> Genom att injicera budbärar-RNA. Den intracellulära lösning under inspelningarna patch clamp styrs av en perfusion system.
Abstract
Protokollet som presenteras här är utformade för att studera aktivering av stora konduktans, spänning-och Ca 2 +-aktiverade K + (BK) kanaler. Protokollet kan också användas för att studera struktur och funktion relation till andra jonkanaler och receptorer signalsubstans 1. BK-kanaler är allmänt uttrycks i olika vävnader och har varit inblandade i många fysiologiska funktioner, inklusive reglering av glatt muskulatur kontraktion, frekvensinställning av inre hårceller och reglering av frisättningen av neurotransmittorer 2-6. BK-kanaler aktiveras av membran depolarisation och intracellulära Ca 2 + och Mg 2 + 6-9. Därför är det protokoll som utformats för att styra både membranet spänningen och den intracellulära lösningen. I detta protokoll, budbärar-RNA av BK-kanaler injiceras i Xenopus laevis oocyter (fas V-VI) följt av 2-5 dagars inkubation vid 18 ° C 10-13. Membran fläckar som innehåller ett eller flera BK kanaler exciderad med insidan ut konfigurering med hjälp av tekniker patch clamp 10-13. Den intracellulära sidan av plåstret är perfusion med önskade lösningar under inspelningen så att kanalen aktiveringen under olika förhållanden kan undersökas. Sammanfattningsvis är mRNA av BK-kanaler injiceras i Xenopus laevis oocyter att uttrycka kanal proteiner på äggcellen membranet, patch clamp teknik används för att spela in strömmar som flyter genom kanaler under kontrollerade spänning och intracellulära lösningar.
Protocol
Discussion
Äggcellen Uttrycket Systemet är idealiskt för elektrofysiologiska karakterisering av spänningsberoende jonkanaler De relativt låga bakgrund av endogent kanaler. Eftersom det är ett övergående uttryck system, ger det en effektiv metod för att utföra mutagenes studie av dessa kanaler. Det bör dock noteras att äggcellen uttrycket systemet är annorlunda än i däggdjursceller, så det kan finnas skillnader i post-translationell modifiering och samverkan med olika subenheter. Dessutom kan lipid koncentration ski…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag R01-HL70393 och R01-NS060706 till JCJC är professor i medicinsk teknik på Spencer T. Olin Endowment.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
Riferimenti
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
