Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados en Xenopus Ovocitos
Summary
Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan en<em> Oocitos de Xenopus</em> Mediante la inyección de ARN mensajero. La solución intracelular durante las grabaciones de patch clamp es controlado por un sistema de perfusión.
Abstract
El protocolo que aquí se presenta está diseñado para estudiar la activación de la gran conductancia, el voltaje y Ca 2 +-K + activado (BK) canales. El protocolo también puede ser usado para estudiar la relación estructura-función de otros canales iónicos y receptores de los neurotransmisores 1. Canales BK se expresan ampliamente en diferentes tejidos y se han implicado en muchas funciones fisiológicas, incluyendo la regulación de la contracción del músculo liso, Ajuste de la frecuencia de las células ciliadas internas y la regulación de la liberación de neurotransmisores 2-6. Canales BK son activados por despolarización de la membrana y por intracelular de Ca 2 + y Mg 2 + 9.6. Por lo tanto, el protocolo está diseñado para controlar tanto el voltaje de la membrana y la solución intracelular. En este protocolo, el ARN mensajero de los canales BK se inyecta en ovocitos de Xenopus laevis (fase V-VI), seguido de 2-5 días de incubación a 18 ° C 10-13. Parches de membrana que contienen canales BK uno o varios son extirpados con la configuración de adentro hacia afuera utilizando técnicas de patch clamp 10-13. La parte intracelular del parche es perfundidos con soluciones deseadas durante la grabación para que la activación del canal en condiciones diferentes pueden ser examinados. En resumen, el ARNm de los canales BK se inyecta en ovocitos de Xenopus laevis que expresan proteínas de canales en la membrana del ovocito, las técnicas de patch clamp se utilizan para registrar las corrientes que fluyen a través de los canales de bajo voltaje controlado y soluciones intracelulares.
Protocol
Discussion
El sistema de expresión de ovocitos es ideal para la caracterización electrofisiológica de los canales iónicos dependientes de voltaje debido a la relativamente baja de fondo de los canales endógenos. Además, dado que se trata de un sistema de expresión transitoria, que proporciona un método eficiente de llevar a cabo el estudio de mutagénesis de estos canales. Sin embargo, cabe señalar que el sistema de expresión de los ovocitos es diferente de la de células de mamíferos, por lo tanto puede haber diferenci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01-R01-HL70393 y NS060706 a JCJC es un profesor de ingeniería biomédica de la Fundación Spencer T. Olin.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
Riferimenti
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