Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes
Summary
Courant ionique des canaux BK est enregistrée en utilisant des techniques de patch-clamp. Canaux BK sont exprimés en<em> Ovocytes de Xenopus</em> En injectant de l'ARN messager. La solution intracellulaire pendant les enregistrements de patch-clamp est contrôlé par un système de perfusion.
Abstract
Le protocole présenté ici est conçu pour étudier l'activation de la conductance grande tension et de Ca 2 +-K + activé (BK) canaux. Le protocole peut également être utilisé pour étudier la relation structure-fonction pour d'autres canaux ioniques et les récepteurs des neurotransmetteurs 1. Canaux BK sont largement exprimés dans différents tissus et ont été impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques, y compris la réglementation de la contraction des muscles lisses, la fréquence d'accord de cellules ciliées internes et la réglementation de libération des neurotransmetteurs 2-6. Canaux BK sont activés par dépolarisation de la membrane et par intracellulaire de Ca 2 + et Mg 2 + 6-9. Par conséquent, le protocole est conçu pour contrôler à la fois la tension de membrane et la solution intracellulaire. Dans ce protocole, l'ARN messager de canaux BK est injecté dans des ovocytes de Xenopus laevis (stade V-VI), suivi de 2-5 jours d'incubation à 18 ° C 10-13. Patches membranaires qui contiennent un ou plusieurs canaux BK sont excisées avec la configuration inside-out en utilisant des techniques de patch-clamp 10-13. Le côté intracellulaire du patch est perfusé avec des solutions souhaitées lors de l'enregistrement de telle sorte que l'activation du canal dans des conditions différentes peuvent être examinés. Pour résumer, l'ARNm de canaux BK est injecté dans des ovocytes de Xenopus laevis pour exprimer des protéines de canal sur la membrane ovocytaire, les techniques de patch-clamp sont utilisés pour enregistrer les courants circulant dans les canaux sous tension contrôlée et des solutions intracellulaires.
Protocol
Discussion
Le système d'expression ovocyte est idéal pour la caractérisation électrophysiologique des canaux ioniques voltage-dépendante due à fond relativement faible des canaux endogènes. Par ailleurs, puisque c'est un système d'expression transitoire, il fournit une méthode efficace de réaliser l'étude de mutagenèse de ces canaux. Cependant, il convient de noter que le système d'expression d'ovocytes est différente de celle des cellules de mammifères, donc il peut y avoir des différences …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de subventions de la santé et la R01-R01-HL70393 NS060706 d'JCJC est un professeur de génie biomédical de la dotation Spencer T. Olin.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
Riferimenti
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