Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti
Summary
Corrente ionica dei canali BK è registrato utilizzando tecniche di patch clamp. Canali BK sono espressi in<em> Ovociti di Xenopus</em> Mediante iniezione di RNA messaggero. La soluzione intracellulare durante le registrazioni di patch clamp è controllato da un sistema di perfusione.
Abstract
Il protocollo presentato qui è stato progettato per studiare l'attivazione della conduttanza di grandi dimensioni, tensione e Ca 2 +-attivati K + (BK) canali. Il protocollo può essere utilizzato anche per studiare il rapporto struttura-funzione di canali ionici e di altri recettori dei neurotrasmettitori 1. Canali BK sono ampiamente espresse in diversi tessuti e sono stati implicati in molte funzioni fisiologiche, tra cui regolazione della contrazione della muscolatura liscia, regolazione frequenza di cellule ciliate interne e la regolamentazione del rilascio dei neurotrasmettitori 2-6. BK canali sono attivati da depolarizzazione della membrana e dal intracellulare di Ca 2 + e Mg 2 + 6-9. Pertanto, il protocollo è stato progettato per controllare sia il potenziale di membrana e la soluzione intracellulare. In questo protocollo, l'RNA messaggero di canali BK viene iniettato in ovociti di Xenopus laevis (stadio V-VI), seguita da 2-5 giorni di incubazione a 18 ° C 10-13. Patch di membrana che contengono uno o più canali BK sono escisse con l'inside-out configurazione utilizzando tecniche di patch clamp 10-13. Il lato intracellulare della patch è perfuso con soluzioni desiderato durante la registrazione in modo che l'attivazione del canale in condizioni diverse può essere esaminato. Per riassumere, l'mRNA dei canali BK viene iniettato in oociti di Xenopus laevis per esprimere le proteine canale sulla membrana dell'ovocita, tecniche di patch clamp vengono utilizzati per registrare la corrente che fluisce attraverso i canali controllati in tensione e soluzioni intracellulari.
Protocol
Discussion
Il sistema di espressione degli ovociti è ideale per la caratterizzazione elettrofisiologica di canali voltaggio-dipendenti di ioni a causa di fondo relativamente basso di canali endogeni. Inoltre, poiché si tratta di un sistema di espressione transiente, fornisce un metodo efficiente di eseguire studi di mutagenesi di questi canali. Tuttavia, va notato che il sistema di espressione ovocita è diverso da quello in cellule di mammifero, quindi ci possono essere differenze di modificazioni post-traduzionali ed associazi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of concede Salute R01-R01-HL70393 e NS060706 a JCJC è Professore di Ingegneria Biomedica sul Spencer T. Olin Endowment.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
Riferimenti
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