イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞
Summary
BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。 BKチャネルはで表されます<em>アフリカツメガエル卵母細胞</em>メッセンジャーRNAを注入することにより。パッチクランプ記録中に細胞内液を灌流システムによって制御されます。
Abstract
大コンダクタンス、電圧およびCa 2 +活性化K +（BK）チャネルの活性化を研究するために設計されているプロトコルは、ここで紹介。プロトコルはまた、他のイオンチャネルや神経伝達物質受容体1の構造機能相関を研究するために使用されることがあります。 BKチャネルは、幅広くさまざまな組織で発現され、平滑筋収縮、内有毛細胞の周波数同調と神経伝達物質放出2-6の規制の規制などを含め多くの生理機能に関与している。 BKチャネルは、膜の脱分極によっておよび細胞内Ca 2 +およびMg 2 + 6〜9によって活性化されています。そのため、プロトコルは、膜電位と細胞内液の両方を制御するように設計されています。このプロトコルでは、BKチャネルのメッセンジャーRNAを18℃で10から13のインキュベーションの2-5日間続いてアフリカツメガエル卵母細胞（ステージV – VI）に注入されます。単一または複数のBKチャネルを含む膜のパッチは、パッチクランプ法を10-13を使用してインサイドアウトの構成で切り出しています。パッチの細胞内側は、異なる条件下でのチャネルの活性化を調べることができるように記録する際に必要なソリューションで灌流される。要約すると、BKチャネルのmRNAは卵母細胞膜上のチャネルタンパク質を発現するアフリカツメガエル卵母細胞に注入され、パッチクランプ技術は、制御電圧と細胞内のソリューションの下にチャネルを流れる電流を記録するために使用されます。
Protocol
Discussion
卵母細胞発現系は、内在性のチャンネルの相対的に低い背景に起因する電位依存性イオンチャネルの電気生理学的特性評価に最適です。さらに、それは一過性発現系なので、それはこれらのチャネルの突然変異誘発試験を行うの効率的な方法を提供する。しかし、それは卵母細胞発現系は、哺乳類細胞では異なることに留意すべきである、したがって、異なるサブユニットと翻訳後修飾との?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、JCJCに健康補助金の国立研究所R01 – HL70393およびR01 – NS060706によってサポートされていましたスペンサーT.オリン基金に関する医工学の教授である。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Perfusion System and Electronic Controller | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Inner diameter of perfusion tip: 100 microns | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX31 | ||
| Glass Pipettes | VWR International | 53432-921 | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | ||
| Amplifier | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | ||
| Computer Interface | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | ||
| Headstage | Axon Instruments | CV 203BU |
Riferimenti
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