Isolering av hjärna och ryggmärg mononukleära celler Använda Percoll Färggradienter
Summary
Den aktuella artikeln beskrivs en snabb protokoll för att effektivt isolera mononukleära celler från hjärnan och ryggmärgen vävnader som kan utnyttjas effektivt för flödescytometrisk analyser.
Abstract
Isolering av immunceller som infiltrerar det centrala nervsystemet (CNS) vid infektion, trauma, autoimmunitet eller neurodegeneration, krävs ofta för att definiera deras fenotyp och effektorfunktioner. Histokemiska metoder bidrar till att bestämma platsen för infiltrera celler och för att analysera samband CNS patologi. Men in-situ histokemi och immunofluorescens tekniker färgning begränsad av antalet antikroppar som kan användas vid ett enskilt tillfälle att karaktärisera immunceller subtyper i en viss vävnad. Därför histologiska metoder i samband med immun-fenotypning med flödescytometri är kritiska till fullo karakterisera sammansättningen av lokala CNS-infiltration. Detta protokoll är baserad på separation av CNS cellulära suspensioner över diskontinuerlig Percoll gradienter. Den aktuella artikeln beskrivs en snabb protokoll för att effektivt isolera mononukleära celler från hjärnan och ryggmärgen vävnader som kan utnyttjas effektivt för identifiering av olika immunceller populationer i ett enda prov med flödescytometri.
Protocol
Discussion
Analyser av markörer på cellytan i CNS leukocyter från normalt och inflammerad mus vävnader har använts i flera decennier 1-3. Isolering protokoll är baserade i separation av mikroglia och leukocyter med densitet centrifugering 4. Här beskriver vi en snabb och effektiv metod för att isolera CNS leukocyter diskontinuerliga Percoll gradienter. Efter isolering av celler, färgning med olika antikroppar, såsom-men inte begränsat till-CD45, tillåter CD4, CD8, CD11b, CD19, etc. identifiering a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T för att AEC) och University of Texas i San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
- Percoll (Amersham)
- 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
- 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
- Cell Staining Buffer (Biolegend)
- Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
- Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)
References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
