Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll
Summary
L'articolo attuale descrive un protocollo rapido per isolare in modo efficace le cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale che può essere efficacemente utilizzato per le analisi di citometria a flusso.
Abstract
Isolamento di cellule immunitarie che si infiltrano nel sistema nervoso centrale (SNC) durante l'infezione, traumi, malattie autoimmuni o neurodegenerazione, è spesso necessaria per definire la loro fenotipo e funzioni effettrici. Approcci istochimiche sono strumentali per determinare la posizione delle celle di infiltrarsi e di analizzare il sistema nervoso centrale associata patologia. Tuttavia, in situ e tecniche di colorazione istochimica immunofluorescenza sono limitati dal numero di anticorpi che possono essere usati in una sola volta a caratterizzare sottotipi di cellule immunitarie in un particolare tessuto. Pertanto, gli approcci istologici in collaborazione con immuno-fenotipo mediante citometria di flusso sono fondamentali per caratterizzare completamente la composizione del locale infiltrazione sistema nervoso centrale. Questo protocollo si basa sulla separazione del sistema nervoso centrale sospensioni cellulari più discontinue gradienti di Percoll. L'articolo attuale descrive un protocollo rapido per isolare in modo efficace le cellule mononucleate da tessuti cerebrali e del midollo spinale che può essere efficacemente utilizzato per l'identificazione delle varie popolazioni di cellule immunitarie in un singolo campione mediante citometria di flusso.
Protocol
Discussion
Le analisi di marcatori cellulari di superficie nei leucociti sistema nervoso centrale dai tessuti del mouse normale e infiammata è stata utilizzata per decenni 1-3. Protocolli di isolamento si basano nella separazione della microglia e leucociti da 4 densità centrifugazione. Qui si descrive un metodo veloce ed efficace di isolare leucociti sistema nervoso centrale mediante gradienti di Percoll discontinuo. Dopo l'isolamento delle cellule, colorazione con anticorpi diversi come ad esempio-ma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Società Nazionale Sclerosi Multipla (TA 3021-A1 / T per AEC) e l'Università del Texas a San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
- Percoll (Amersham)
- 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
- 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
- Cell Staining Buffer (Biolegend)
- Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
- Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)
References
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
