Den aktuella artikeln beskrivs en snabb protokoll för att effektivt isolera mononukleära celler från hjärnan och ryggmärgen vävnader som kan utnyttjas effektivt för flödescytometrisk analyser.
Abstract
Isolering av immunceller som infiltrerar det centrala nervsystemet (CNS) vid infektion, trauma, autoimmunitet eller neurodegeneration, krävs ofta för att definiera deras fenotyp och effektorfunktioner. Histokemiska metoder bidrar till att bestämma platsen för infiltrera celler och för att analysera samband CNS patologi. Men in-situ histokemi och immunofluorescens tekniker färgning begränsad av antalet antikroppar som kan användas vid ett enskilt tillfälle att karaktärisera immunceller subtyper i en viss vävnad. Därför histologiska metoder i samband med immun-fenotypning med flödescytometri är kritiska till fullo karakterisera sammansättningen av lokala CNS-infiltration. Detta protokoll är baserad på separation av CNS cellulära suspensioner över diskontinuerlig Percoll gradienter. Den aktuella artikeln beskrivs en snabb protokoll för att effektivt isolera mononukleära celler från hjärnan och ryggmärgen vävnader som kan utnyttjas effektivt för identifiering av olika immunceller populationer i ett enda prov med flödescytometri.
Protocol
Beredning av reagenser Förbered lager isoton Percoll (SIP), 4 ml per hjärnan, genom att blanda 9 delar Percoll med en del 10X HBSS utan Ca + + och Mg + +. Förbered SIP på 70% i 1X HBSS utan Ca + + och Mg + +, 2 ml per hjärnan dispenseras i en 15 ml polypropylen koniska rör. Observera: Det rekommenderas att Percoll bör användas vid rumstemperatur, om den används kall, celler tenderar att klumpa och cellseparation är mindre effe…
Discussion
Analyser av markörer på cellytan i CNS leukocyter från normalt och inflammerad mus vävnader har använts i flera decennier 1-3. Isolering protokoll är baserade i separation av mikroglia och leukocyter med densitet centrifugering 4. Här beskriver vi en snabb och effektiv metod för att isolera CNS leukocyter diskontinuerliga Percoll gradienter. Efter isolering av celler, färgning med olika antikroppar, såsom-men inte begränsat till-CD45, tillåter CD4, CD8, CD11b, CD19, etc. identifiering a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T för att AEC) och University of Texas i San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Percoll (Amersham)
10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
Cell Staining Buffer (Biolegend)
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients. J. Vis. Exp. (48), e2348, doi:10.3791/2348 (2011).