Microdisección de Negro Araña Viuda producción de las glándulas de seda

Summary

A continuación se describe una estrategia eficaz para extirpar las glándulas productoras de seda desde el abdomen de la mujer araña viuda negro. Este procedimiento permite el rápido aislamiento de los productores de seda siete diferentes glándulas de una forma altamente purificada, un proceso importante para los investigadores que estudian la producción de la seda de araña y el montaje de la fibra.

Abstract

Arañas modernas giro fibras de alto rendimiento de seda con una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la captura de presas de locomoción, y la protección del desarrollo de ^1,2 hijos. Arañas realizar estas tareas al girar varios tipos de fibras distintas que tienen diferentes propiedades mecánicas. Esta especialización de los tipos de fibra se ha producido a través de la evolución de las diferentes glándulas productoras de seda, que funcionan como biofábricas pequeños. Estos fabricación biofábricas y almacenar grandes cantidades de proteínas de seda para la producción de fibra. A través de una serie compleja de eventos bioquímicos, estas proteínas de la seda se convierten de un líquido en un material sólido con la extrusión.

Estudios de mecánica han demostrado que las sedas de araña es más fuerte que acero de alta resistencia ^3. Los análisis para comprender la relación entre la estructura y función de hilos de seda de araña han revelado que la seda de araña consiste en gran parte de las proteínas, o fibroins, que se repite dentro de su bloque de secuencias de proteínas ^4. Común firmas moleculares que contribuyen a la resistencia a la tracción increíble y la extensibilidad de las sedas de araña se deshizo a través del análisis de ADNc de seda traducido. Teniendo en cuenta las propiedades del material extraordinario de araña sedas, los laboratorios de investigación en todo el mundo están compitiendo para comprender y simular el proceso de hilado para producir fibras sintéticas de seda para aplicaciones comerciales, industriales y militares. Uno de los principales desafíos a la hilatura de seda de araña artificial en el laboratorio de investigación consiste en un completo entendimiento de los procesos bioquímicos que ocurren durante la extrusión de las fibras de las glándulas productoras de seda.

Aquí presentamos un método para el aislamiento de los siete productores de seda diferentes glándulas de la araña viuda cobweaving negro, que incluye las glándulas ampullate mayores y menores [fabrica de seda draga y andamios] ^5,6, tubuliform [huevo sintetiza seda caso] ^{7 , 8,} flagelliform [función desconocida en la mazorca de los tejedores], agregado [hace cola de seda], aciniform [envolver la presa sintetiza las discusiones y huevo caso] ⁹ y piriforme [archivo adjunto produce seda disco] ^10. Este enfoque se basa en anestesiar a la araña con el gas de dióxido de carbono, la posterior separación del cefalotórax del abdomen, y microdisección del abdomen para obtener las glándulas productoras de seda. Tras la separación de los diferentes productores de seda glándulas, estos tejidos se pueden utilizar para recuperar las macromoléculas diferentes para los distintos análisis bioquímicos, incluyendo cuantitativos PCR en tiempo real, en el norte y el Western Blot, análisis de espectrometría de masas (MS o MS / MS) para identificar nuevas secuencias de proteínas de seda, la búsqueda de proteínas que participan en la ruta de la seda de montaje, o usar el tejido intacto para el cultivo celular o histológico experimentos.

Protocol

1. Anestesiar a la araña y el aislamiento del abdomen La transferencia de la araña de un frasco de vidrio en una caja de cartón forrada con plástico (Figura 1). Por lo general recogen las arañas de las pilas de madera, garajes o arbustos y la casa en el laboratorio en frascos de vidrio. Debido a que la araña no puede subir por las paredes de plástico, que proporciona un método eficiente para la transferencia de la araña de un frasco de vidrio o lata de café en un frasco más pequeño para fines de a…

Discussion

Nuestra metodología para la microdisección de las glándulas productoras de seda de la araña viuda negro ofrece un medio eficaz para obtener altamente purificada producir seda glándulas. Disecciones se puede completar en 1,5 a 3 horas, produciendo un conjunto completo de las siete distintas glándulas productoras de seda de cobweavers. La obtención de alta pureza glándula de seda muestras permite a los investigadores la posibilidad de realizar una amplia gama de estudios bioquímicos, incluyendo la identificación…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Sodium chloride		EM Science	SX0420-1	0.1 M in water
Diethyl pyrocarbonate		Sigma	D-5758 – 5 ml	0.1% v/v
Sodium citrate		Sigma	S1804 – 1 kg	0.015 M in water
Dissecting microscope		Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera		Leica Microsystems	DFC320	Software – Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors		World Precision Instruments	500260
Stainless steel forceps		World Precision Instruments	501764	Mini Dumont #M5S
Insect pins		Indigo Instruments	33414-2	Insect pins #2
Small or large dissection dishes		Living Systems Instrumentation	DD-50-S or DD-90-S	52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm
Drosophila culture vials		Carolina Biological Supply Company	FR-17-3076	Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm