Gist Colony integratiemethode
Summary
Een methode voor het inbedden gistkolonies waardoor snijden voor licht-en elektronenmicroscopie. Dit protocol maakt de bepaling van de verdeling van gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen in kolonies die een nieuwe tool in de richting van het begrijpen van de organisatie van de celtypen in een schimmel gemeenschap.
Abstract
Patroonvorming van de verschillende celtypes in embryo's is een belangrijk mechanisme in metazoïsche ontwikkeling. Gemeenschappen van micro-organismen, zoals de koloniën en biofilms ook weer patronen van celtypen. Bijvoorbeeld, in de gist S. cerevisiae, zijn gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen niet uniform verdeeld in kolonies. De functionele betekenis van patronen en de moleculaire mechanismen die deze patronen ten grondslag liggen zijn nog slecht begrepen.
Een van de uitdagingen met betrekking tot de onderzoeken van patronen van celtypen in schimmelkolonies is dat in tegenstelling tot metazoïsche weefsel, cellen in kolonies relatief zwak aan elkaar gehecht. In het bijzonder, hebben schimmelkolonies bevat niet dezelfde uitgebreide niveau van extracellulaire matrix gevonden in de meeste weefsels. Hier doen we verslag van een methode voor het inbedden en snijden gistkolonies dat het interieur patronen van celtypes openbaart in deze kolonies. De methode kan gebruikt worden om dikke secties voor te bereiden (0,5 μ) nuttig zijn voor lichtmicroscopie en dunne secties (0,1 μ) geschikt voor transmissie elektronenmicroscopie. ASCI en pseudohyfale cellen kunnen gemakkelijk te onderscheiden van eivormige gistcellen met lichtmicroscopie, terwijl het interieur structuur van deze cellen kan worden gevisualiseerd door EM.
De methode is gebaseerd op de omliggende kolonies met agar, infiltreert ze met medium Spurr, en dan snijden. Kolonies met een diameter in het bereik van 1-2 mm zijn geschikt voor dit protocol. In aanvulling op het visualiseren van het interieur van de kolonies, de methode maakt het mogelijk visualisatie van de regio van de kolonie dat de onderliggende agar binnendringt.
Protocol
Discussion
De gepresenteerde methode toont het interieur structuren van de kolonies. Omdat de methode effectief is bij het bepalen van de patronen van celtypen in een reeks van S. cerevisiae stammen met verschillende kolonie morfologie, en ook in een verwante soorten S. paradoxus 5, de methode is ook kans om te werken op een breed scala van schimmels en andere micro-organismen.
Een kritische stap voor het succes van de methode is om ervoor te zorgen dat de gehele kolonie, waar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek werd gefinancierd door NIH 1R15GM094770.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | ||
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | ||
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 | |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 | |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA | |
| 2-Dimethyl aminoethanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE | |
| Mounting media | KPL | 71-00-16 | ||
| Rotating wheel | Ted Pella | Pelco 1055 | ||
| Microtome | Leica | Ultracut S |
References
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genetics. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
