Hefekolonie Embedding-Methode
Summary
Eine Methode zur Einbettung von Hefe-Kolonien ermöglicht Schnitte für Licht-und Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll erlaubt die Bestimmung der Verteilung der sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen innerhalb Kolonien bietet ein neues Werkzeug zum Verständnis der Organisation von Zelltypen innerhalb eines Pilz-Gemeinschaft.
Abstract
Strukturierung von verschiedenen Zelltypen im Embryo ist ein wichtiger Mechanismus in Metazoen Entwicklung. Gemeinschaften von Mikroorganismen, wie Kolonien und Biofilmen zeigen auch Muster von Zelltypen. Zum Beispiel in der Hefe S. cerevisiae, sind sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen nicht gleichmäßig in Kolonien verteilt. Die funktionelle Bedeutung der Strukturierung und der molekularen Mechanismen, die diese Muster zugrunde liegen, sind noch weitgehend unverstanden.
Eine Herausforderung in Bezug auf die Untersuchung Muster von Zelltypen in Pilzkolonien ist, dass im Gegensatz zu vielzelligen Gewebe, Zellen in Kolonien relativ schwach miteinander verbunden. Insbesondere sollten Sie Pilzkolonien nicht die gleichen umfangreichen Ebene der extrazellulären Matrix in den meisten Geweben gefunden. Hier berichten wir über eine Methode zum Einbetten und Schneiden Hefekolonien, dass das Innere Muster von Zelltypen zeigt in diesen Kolonien. Die Methode kann verwendet werden, um dicke Abschnitte vorbereiten (0,5 μ) sinnvoll für die Lichtmikroskopie und dünne Schnitte (0,1 μ) für Transmissions-Elektronenmikroskopie werden. Asci und pseudohyphal Zellen können leicht von eiförmige Hefezellen mittels Lichtmikroskopie unterschieden werden, während die innere Struktur dieser Zellen können mit Hilfe von EM.
Die Methode basiert auf umliegenden Kolonien mit Agar-Agar, infiltrieren sie mit Spurr das Medium, und dann Schnitte basieren. Kolonien mit einem Durchmesser im Bereich von 1-2 mm eignen sich für dieses Protokoll. Zusätzlich zu visualisieren das Innere der Kolonien, erlaubt das Verfahren die Visualisierung der Region der Kolonie, dass die zugrunde liegenden Agar eindringt.
Protocol
Discussion
Die vorgestellte Methode zeigt, die inneren Strukturen der Kolonien. Da die Methode ist effektiv bei der Bestimmung Muster von Zelltypen in einer Reihe von S. cerevisiae-Stämme mit unterschiedlichen Morphologien Kolonie, und auch in einer verwandten Spezies S. paradoxus 5, ist das Verfahren auch am ehesten auf eine breite Palette von Pilzen und anderen Mikroorganismen zu arbeiten.
Ein entscheidender Schritt für den Erfolg der Methode ist, um sicherzustellen, dass die ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung wurde durch die NIH 1R15GM094770 finanziert.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | ||
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | ||
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 | |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 | |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA | |
| 2-Dimethyl aminoethanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE | |
| Mounting media | KPL | 71-00-16 | ||
| Rotating wheel | Ted Pella | Pelco 1055 | ||
| Microtome | Leica | Ultracut S |
References
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