ヘキストの分離および特性評価^低 CD45^負マウス肺間葉系幹細胞

Summary

この記事では、マウスの常駐肺間葉系幹細胞（肺MSC）、それらの拡大、特性評価および免疫調節特性の分析の分離を示しています。

Abstract

組織の居住者間葉系幹細胞（MSC）は、組織の修復や再生、線維症、炎症、血管新生と腫瘍形成の重要な調節因子である。これらの研究は、居住者の肺のMSCは、このような肺線維症（PF）と動脈性高血圧症（PAH）などの疾患時の肺組織の恒常性、損傷および修復の間に役割を果たすことを示唆して一緒になって。ここでは、居住者の肺のMSCの人口を定義するために技術を説明します。この人口の定義は、in vivoでのマーカーのセットを定義を使って肺組織では、フローサイトメトリーおよび特定の細胞型と機能の研究により、十分に特徴付けられた幹細胞集団の繰り返し分離を容易にします。

Protocol

1。肺の分離

1. 無菌テクニックを使用して放血が続くイソフルランの過剰摂取によるマウス成体マウス（; 18〜20グラムC57Bl6J年齢8〜10週）を生け贄に捧げる。プロファイルには、菌株間でわずかに異なります。
2. 外科的にダイヤフラムを削除する、マウスの各側面に横方向に胸郭を切断することにより胸腔を開く。優しくリン酸の3 - 5mlsを使用して、右心臓の心室を灌流することによって肺から血液をフラッシュには生理食塩水（PBS）を。
3. （HBSS）緩衝生理食塩水ハンクスで満たされたペトリ皿で​​気管と大きな気管支と場所を削除する肺葉を解剖。すべての肺葉の鉗子の次のコレクションは、皿の蓋の上に組織を置くために使用されます。組織は、それらが浮くと移動するほど、それらは湿ったではなく、維持するのに十分な液体で使い捨て外科用メスを用いて小さな部分に刻まれて。
4. マウスの一つの後肢を摘出し、FLOを設定するには、染色のコントロールとして使用するために骨髄を分離ワットメトリーゲート。前述^1に記載の骨髄（BM）を染色。

2。肺組織からの単細胞懸濁液の調製

1. 、滅菌HBSSに溶解したワーシントン2型コラゲナーゼ（猫＃LS004202ワージントンの生化学、レイクウッド、ニュージャージー州）は、予め温めておいた0.2％の5mls：各肺は、0.2グラムの体積比に最適化された組織の重量を用いて消化する。混合物を30分間^2,3に対して37℃の水浴中に浸漬される。
2. 肺組織のダイジェストが10ミリリットルピペット（約10回の繰り返し）を介して容易に流れるまで、よくサンプルを砕いて粉にする。 37℃でさらに15分間インキュベート° Cは、組織がより均一な単一の細胞懸濁液を消化し、確実に完了する。
3. HBSSによる肺の細胞懸濁液を希釈し、残存組織の断片を分散させるために5ミリリットルピペットでひいて粉にする。
4. 未消化の組織片を除去するために70μMセルストレーナーを使用してサスペンションをフィルタリングする。サンプルはmultiplに分けることができます。一つのセルストレーナーの過負荷を防止し、時間を短縮するためにこの時点でeはコニカルチューブ。
5. ペレット1500rpmでと上清をデカントで10分間、細胞懸濁液。
6. 5分間室温でインキュベート、再懸濁し、細胞ペレットを穏やかに室温RBC溶解バッファー（猫＃00-4333-57 eBiosciences、サンディエゴ、CA）を使用。溶解バッファーを不活化し、破片と細胞の凝集物を除去するために40μmのセルストレイナーを使用して細胞懸濁液をフィルタするためにHBSSの等量を追加。
7. 各サンプルのピペット10μLが煤けると肺と血球計数器を用いてBM試料の両方の細胞数をカウントする。注：セルの合計量を記録する。
8. ペレット10分間1500rpmで遠心分離による肺細胞の単一の細胞懸濁液。
9. 猫＃11965-092）を含む2％ウシ胎児bovi、温めておいたで1 × 10 ⁶細胞/ ml（37℃）DMEM +（ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州はで肺と骨髄細胞の両方を再懸濁しますNE血清（FBS）および10mMのHEPES。
10. ヘキスト33342色素（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ、猫＃B2261）の1mg/mlのストック溶液の準備水のをと^1,4を殺菌フィルタ。ヘキスト染料は、-80℃でアリコートとして格納されることがあります
11. 単一の細胞懸濁液に5μg/mlの最終濃度（1mg/mlの株式の200倍希釈）にHoescht 33342染料を追加。
12. 37正確に90分間° Cの水浴中で穏やかに反転し、インキュベートして細胞を混ぜる。

3。染色とフローサイトメトリー分析のための肺の細胞懸濁液の調製

1. 90分後にヘキスト染色した肺の細胞を持つすべてのステップは、色素流出を防ぐために、4℃または氷上で実行する必要があります。 4℃で10分間1500rpmで遠心分離によってペレットは、細胞℃、氷冷染色バッファー（PBS 2パーセントFBS）で細胞を再懸濁する。
2. 2％含有するPBSの300 -600μl使用しない以上の⁷ × 10以上の細胞/チューブの濃度で再懸濁し、細胞FBSと10mMのHEPES。
3. 。肺とBM試料の猫＃559864）氷上で10〜15分間インキュベート中に非染色制御を含む;。十分にCD45抗体を（通常はCD45 - APC（BD Pharmingen社、サンディエゴ、カリフォルニア州の1:200希釈tittered追加実験手順は、分析のゲートを設定すると便利です。
4. 4で、細胞をペレット化する° C、1500 rpmで5分間。チルド染色バッファー（PBS 2パーセントFBS）500μlの上清と再懸細胞をデカントします。 （;猫＃14から956 - 1D Fisherbrand、イリノイ州シャンバーグ）予冷したスナップキャップポリプロピレンチューブに移す。
5. 死細胞を除外するために2μg/mlの最終濃度試料にヨウ化プロピジウム（PI、PBSで200μg/mlの株式）を追加します。 PIは、フローサイトメトリー解析の際に正しい蛍光プロファイルを達成するためにヘキスト33342色素と組み合わせて使用​​する必要があります。
6. フローサイトメトリー分析まで、光から保護チューブを氷中に、保管してください。

4。定義と分離するフローサイトメトリー分析サイドポピュレーション（SP）を検出するためのヘキスト色素流出を使用して肺間葉系幹細胞（肺MSC）人口

1. このアッセイは、以下の機器の要件があります。
• 488 nmのとUV（350〜355 nm）のレーザー
• 青（65分の450）と赤（50分の675）フィルターとUVレーザーのパス上の2検出器。
• UV赤検出器は、赤の信号のための高感度を持っている必要があります。これは古いセルソーターによる問題である可能性があります。
• 50から10にサンプルを維持するためにチラーユニット℃に
2. レーザーの位置を合わせ、製造業者のプロトコルに従って細胞選別のために設定する。
3. 赤（x軸）と青（y軸）リニアスケールを使用してヘキスト信号を収集する。
4. トレーリング側の人口の適切な表示を可能にするために、プロット上の中心の右上にG0/G1ピークを配置する光電子増倍管の電圧を調整します。細胞周期のS期とG2全体の部分は、プロットの右上にオフスケールの可能性があります。青SIG赤の信号が暗いしながら内部は比較的明るいです。典型的なMoFlo XDP（ベックマンコールター、マイアミ、フロリダ州）の電圧は青のための425および赤色650です。
5. 死細胞は、PIを用いてゲートです。標準のPIのパス（励起488nmの、放射630nm）を用いることができる。また、PIはplot（SP）UVレーザーで励起し、死細胞集団は、オフスケールは、サイドポピュレーションの右側に位置しています。これは、FITCやPEなどの他の蛍光色素からPI信号を補正する必要がなくなります。オリジナルのグッデルの方法は^5-7後者手順を追った。
6. 分析中に、比較的低い圧力差を維持し、サイドポピュレーションのタイトな解像度を確保するためのソート。
7. SPは、肺の細胞の主要な集団から離れてサイドアームとして表示されます。この人口は、ヘキスト^ローと呼ばれます。
8. ヘキスト^低 / SPは、ヒストグラム^2,3（Fを用いてCD45陽性および陰性集団を分離するために分析されigure 1）。
9. ヘキスト^低い CD45 ^NEG肺MSCの人口の選定およびゲーティングに続いて、細胞を96ウェルプレート³にクローンを単離するためにチューブまたは、単一の細胞にいずれかの混合集団としてソートすることで収集されることがあります。
10. プレートは、ソートのストリームのたわみをソートするため、通常はチューブのソートに使用するよりも縦のソートのストリームを作成するために25％に調整されます。
11. 左上にテストストリームのパルスを送信し、96ウェルプレートのウェル右下でソートストリームを目指しています。
12. 各ウェルに希望のセル数を堆積させるソーターのソフトウェア板のマップを設定します。
13. 単一の細胞クローンを単離するために、単一の肺のMSCは培養培地の150μL（α- MEM 20％FBSを添加した）に96ウェルプレートのウェルにソートされます。ソート後培地の追加の100μlのが追加されます。

5。肺MSCとクローンの単離、培養および特性評価

1. Culturソートは、次の電子との混合肺のMSCの人口と、単一の細胞クローンの拡大は、標準的な培養条件を用いて同じです（37℃、5％CO ₂および> 95％湿度）。細胞は16時間以下の分離を付着させています。メディアは、（α- MEM 20％FBSを添加した）、48時間毎に置換されます。ときに細胞がより急速に増殖し、それらが継代されている75から80パーセントの合流点（図2）の間に到達し始める。
2. 細胞を温めておいたHBSSでリンスし、0.5％トリプシン/ EDTA（Cellgro、マナサス、バージニア州、猫＃25 - 053 - Cl）とインキュベートする37℃で2分未満のためのC。細胞は、細胞懸濁液の外観を確認するために反転範囲を使用して監視されます。
3. 肺MSCは、文化の現在の増殖速度に応じて1:2または1:3の比率で分割されます。
4. 伝統的な間葉系脂肪細胞や軟骨細胞、骨芽細胞の系統、と受け入れられる間葉系マーカーの彼らの細胞表面発現に分化するために肺のMSCの能力Isは、それぞれの細胞調製のために評価した。細胞遺伝学的バンド分析も総染色体異常^2,3,8-11の不在を確認するために実行されます。

6。コロニー形成アッセイを使用して肺のMSCの列挙（CFU - F）

1. 1 × 10 ⁶細胞/ mlの最終濃度に完全MesenCult媒体（幹細胞技術、バンクーバー、BC）で細胞を希釈する。
2. メディア10mlの中の6 × 10 ⁴細胞、3 × 10 ⁴細胞、1.5 × 10 ⁴細胞を、0.75 × 10 ⁴細胞の100mmディッシュの最終濃度を達成するために段階希釈を行います。分析は、それぞれの細胞濃度のために重複したり、三連で行われており、小さな表面積に比例してスケールアップすることができる。
3. 標準的な条件下で10日間の培養細胞。日に10細胞をPBSで洗浄し、室温で5分間、100％メタノールを使用して固定されています。
4. 0.4パーセントw / vのギムザ染色液で染色によりCFU - Fのコロニーを検出する（シグマケミカル株式会社、セントルイス、MO）脱イオン水で1:20に希釈。空気乾燥して試料を許可し、コロニー当たり25細胞（図3）よりも大きいを含むコロニーの数を定量化する。

7。 T細胞の増殖とアポトーシスに対する肺のMSCの免疫調節特性の解析

1. ウェルあたり6.25x10 ⁴肺のMSCの細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩^2を放置している。
2. CD4 ⁺卵白323〜339ペプチドを認識するT細胞とT細胞受容体（TCR）トランスジェニックマウス、OT - IIの脾臓から細胞、CD8を枯渇させることによって精製されている^{+、CD19 +、MHC} - II ⁺およびCD25 ⁺細胞と国内でのみ有効AutoMACSセルソーター（ミルテニー、オーバーン、カリフォルニア州）。抗原提示細胞（APC）は、積極的にMHC - II ⁺細胞^12をソートすることによって分離されています。
3. APCは、4％パラホルムアルデヒドで固定し、PBS / 5％BSA/2mM EDTAで3回洗浄し、0.5μg/mlまたは5μg/ mでロードされますリットルOVA323ペプチド。
4. シミュレートされた、APC逮捕成長を96ウェルプレートでの肺のMSCに追加されます。
5. 95％以上の純粋なCD4 + 1 × 10 ⁵細胞は5μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE、シグマ、セントルイス、MO）で標識されているPBSで、暗所で5分間インキュベートし、PBS - 5％BSAで洗浄し、その後に追加DMEM 5％FBS培地でAPCと肺のMSC細胞。その後、細胞を96時間インキュベートする。
6. CD4（APC - Cy7）; CD8（ViolBlue）、T -細胞は、抗抗CD40（Cy5）で染色されるVbeta 5（PE）と国内でのみ有効MacsQuant 7チャンネルのフローサイトメーター（ミルテニー、Aurburn、CA）とを用いてアッセイFloJo解析ソフトウェア（Treestar、オレゴン州アッシュランド）。増殖は背景に比べて、T細胞はCFSEで標識し、APC（図4）にさらされていないCFSEの蛍光強度の平均の減少として測定されます。 T -細胞はトリパンブルー排除で評価この時間と生存率にカウントされます。

8。代表的な結果：

図1フローサイトメトリー分析および肺のMSCの定義 。肺組織ダイジェストの単一の細胞懸濁液は、Hoechst 33342で染色し、違いを検出するフローサイトメトリーによって分析されています。前方散乱光（FSC）と側方散乱（SSC）とB。ヘキスト青色と赤色蛍光。サイドポピュレーション（SP）の存在は、ゲートに表示されます。ヘキスト^低い SPは、次にCを分離するために分析されます。肺のMSCのCD45 ^陰性人口。肺SPの負の比率に正のCD45は、一般的に70:30 / 60:40です。

図2肺MSCの単離と文化 。細胞選別により、肺のMSCのコレクションに続いて、細胞は、α- MEM supplemを使用して30ミリメートル皿にプレートされています20％FBSを取得済み。。新しくソートされた細胞は、小さな丸いと明るく表示されます。B。間葉系の表現型を有する約2〜3週間のコロニー後に明らかになると増殖がより明らかです。

図3。コロニー形成、線維芽細胞アッセイによるMSCの列挙。拡大肺MSCは、A.は、10日後。CFU - Fアッセイ用に記述されているプロトコルごとに播種し、ギムザ染色コロニーは明らかですしている。B.のコロニーが大きくなるとで構成される数百個の細胞。C.細胞が間葉系の表現型を表示します。 ＆B、スケールバー= 0.5センチメートル、Cのスケールバー= 0.14センチメートル。

図4。CFSEベースのT細胞増殖アッセイ 。肺のMSCとantigeの存在の有無にN提示細胞（APC）+ / -オボアルブミン（OVA）CD40 ^{ポジティブ}エフェクターT細胞は、（赤い丸）の増殖を示すCFSEの強度の減少を示しています。 T -細胞膜のCFSEの蛍光強度はすべての細胞分裂の例で化学量論的に減少する。すべての分裂と。肺MSC、APC + /の存在下で- OVA、CD40 ^正のエフェクターT細胞の増殖（赤い円）が不足していることを示すCFSEの強度には有意な変化を示さない。

Discussion

我々は当初、居住者の肺のMSCの特定の集団を単離するためにBM造血細胞を識別するために使用される手法を適応している。分離の再現性に起因するこれらの細胞は、その後もMSCとして特徴づけられた。その起源は、成体マウスの肺における居住者（のような派生BMとは対照的に）と^2を文書化表現型と分子プロファイルとして定義されています。繰り返しこの特徴集団を単離する能力は、組織の恒常性と疾患の間に肺のMSCの生物学的重要性と役割のさらなる研究が可能になります。マウスとヒトの両方の肺組織のin vivoでのこの集団の最近の定義は、傷害と疾病の間に肺の修復を促進する内因性細胞の救出に向けられた治療戦略の開発を容易にします。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P-5368
Hanks buffered salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30588.01
0.2% Worthington type 2 collagenase	Worthington Biochemical	LS004202
Red blood cell lysis buffer	eBioscience	00-4333-57
DMEM	Invitrogen	11965-092
H–chst 33342 dye	Sigma-Aldrich	B2261
CD45-APC	BD Biosciences	559864
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	81845
a-MEM	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30265.01
FBS	Invitrogen	16000-069
0.5% trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-Cl
Complete MesenCult Medium	Stem Cell Technologies	05511
0.4% w/v Giemsa staining solution	Sigma-Aldrich	GS1L
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	16% paraformeldehyde is diluted to 4% using PBS
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Sigma-Aldrich	21888