Summary
I denne artikkelen viser vi isolering av murine bosatt lunge stamceller (lunge MSC), deres ekspansjon, karakterisering og analyse av immunmodulerende egenskaper.
Abstract
Tissue bosatt stamceller (MSC) er viktige regulatorer av vev reparasjon eller fornyelse, fibrose, betennelse, angiogenese og tumor formasjon. Samlet utgjør disse studiene tyder på at hjemmehørende lunge MSC spille en rolle under lunge vev homeostase, skade og reparasjon i løpet av sykdommer som lungefibrose (PF) og arteriell hypertensjon (PAH). Her vil vi beskrive en teknologi for å definere en populasjon av bosatt lunge MSC. Definisjonen av denne pasientgruppen in vivo lunge vev ved hjelp av en definere sett med markører forenkler gjentatte isolering av et godt karakterisert stamcelle befolkningen ved flowcytometri og studiet av en bestemt celletype og funksjon.
Protocol
1. Lung Isolation
- Offer voksen mus (8-10 uker i alder, 18-20 g; C57Bl6J) mus med en overdose av isofluran etterfulgt av exsanguination bruke steril teknikk. Profiler vil variere noe mellom stammer.
- Kirurgisk fjerne mellomgulvet, åpne opp brysthulen ved å kutte brystkasse lateralt på hver side av musen. Skyll blodet fra lungene ved perfusing rett hjertet ventrikkel forsiktig med 3-5mls av fosfat buffered saltvann (PBS).
- Dissekere lungene lober fjerne trachea og store bronkier og plasser i en petriskål fylt med Hanks buffered saltvann (HBSS). Etter samling av alle lunge lapper pinsett brukes til å plassere vev på lokket av fatet. Tissue er da hakket i bittesmå biter bruker engangs skalpeller med nok væske for å holde dem fuktig, men ikke så mye at de flyte og bevege seg.
- Dissekere en hindlimb av en av musene og isolere benmargen til å bruke som en beising kontroll å sette flow cytometri porter. Stain benmarg (BM) som tidligere beskrevet en.
2. Utarbeidelse av en enkelt celle Suspensjon fra Lung Tissue
- Hver lunge er fordøyd ved hjelp av en optimalisert vev vekt og volum ratio of 0.2g: 5mls av forvarmet 0,2% Worthington type 2 collagenase (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ, katt # LS004202) oppløst i sterile HBSS. Blandingen er nedsenket i en 37 ° C vannbad i 30 min 2,3.
- Triturate prøvebrønnen inntil lungevevet fordøye flyter lett gjennom en 10 ml pipette (ca 10 repetisjoner). Inkuber for ytterligere 15 min ved 37 ° C for å fullføre vev fordøyer og sikrer en mer enhetlig enkelt celle suspensjon.
- Fortynn lunge cellesuspensjonen med HBSS og triturate med en 5 ml pipette for å spre gjenværende vev fragmenter.
- Filter suspensjonen med en 70μM celle sil for å fjerne ufordøyde vev fragmenter. Eksempel kan deles inn multiple koniske rør på dette punktet for å hindre overbelastning av en celle sil og redusere tiden.
- Pellet cellen suspensjon 10 min ved 1500 rpm og dekanter supernatanten.
- Resuspender cellepelleten forsiktig bruk romtemperatur RBC lysis buffer (eBiosciences, San Diego, CA, katt # 00-4333-57) og inkuber ved RT i 5 min. Legg til et likt volum av HBSS å inaktivere lysis buffer og filtrere cellesuspensjonen bruke en 40μM celle sil for å fjerne rusk og celle aggregater.
- Pipette 10μl av hver prøve å være farget og telle celle tall for både lunge og BM prøver å bruke en hemocytometer. Merk: registrere det totale volumet av cellene.
- Pellet den enkelt celle suspensjon av lungeceller ved sentrifugering ved 1500 rpm i 10 min.
- Resuspender både lunge og BM celler på 1x10 6 celler / ml i forvarmet (37 ° C) DMEM + (Dulbecco modifiserte Eagle medium, høye glukose (Gibco, Carlsbad, CA, katt # 11965-092) som inneholder 2% fetal bovine serum (FBS) og 10mm HEPES.
- Klargjør en 1mg/ml stamløsning av Hoechst 33342 fargestoff (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO, katt # B2261) i vann og filter sterilisere 1,4. Den Hoechst fargestoff kan lagres som alikvoter ved -80 ° C.
- Legg Hoescht 33342 fargestoff til en endelig konsentrasjon av 5μg/ml (en 200x fortynning av en 1mg/ml lager) til den enkelt celle suspensjon.
- Bland cellene ved forsiktig vending og inkuberes i 37 ° C vannbad for nøyaktig 90 minutter.
3. Flekker og klargjøring av Lung Cell Suspension for flowcytometrisystemer Analysis
- Etter 90 min alle trinn med Hoechst farget lungeceller skal bli henrettet ved 4 ° C eller på is for å hindre dye effluks. Pellet cellene ved sentrifugering ved 1500 rpm i 10 min ved 4 ° C og resuspender cellene i iskaldt flekker buffer (PBS 2% FBS).
- Suspender cellene i en konsentrasjon av ikke mer enn 1x10 7 celler / tube med 300-600μl av PBS som inneholder 2%FBS og 10mm HEPES.
- Legg tilstrekkelig kniste CD45 antistoff (vanligvis 1:200 fortynning av CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA, katt # 559864) til lungene og BM prøver Inkuber på is for 10-15 min Inkludert en unstained kontroll under.. eksperimentell prosedyre er nyttig å sette analysen portene.
- Pellet celler ved 4 ° C i 5 min ved 1500 rpm. Dekanter supernatanten og resuspender celler i 500 mL av kjølte flekker buffer (PBS 2% FBS). Overføring til prechilled knipse cap polypropylen rør (Fisherbrand, Schaumburg, IL, katt # 14-956-1D).
- Legg propidium jodid (PI, 200μg/ml lager i PBS) til prøvene for en endelig konsentrasjon av 2μg/ml å ekskludere døde celler. PI må brukes i kombinasjon med Hoechst 33342 fargestoff for å oppnå riktig fluorescens profilen på flowcytometrisk analyse.
- Lagre rørene på is, beskyttet fra lys til flowcytometri analyse.
Fire. Flowcytometrisystemer Analyse til å definere og Isoleren Lung mesenchymale Stem Cell (lunge MSC) Befolkning med Hoechst fargestoff effluks å oppdage en Side Innbyggere (SP)
- Denne analysen har følgende instrument krav:
- 488 nm og UV (350-355 nm) lasere
- To detektorer på UV laser banen med blå (450/65) og rød (675/50) filtre.
- UV røde Detektoren må ha høy følsomhet for rødt signal. Dette kan være et problem med eldre celle sorterere.
- Chiller enhet for å opprettholde prøven på 5-10 ° C.
- Juster lasere og satt opp for celle sortering følge produsentens protokollen.
- Samle den røde (x-akse) og blå (y-aksen) Hoechst signaler ved hjelp av en lineær skala.
- Juster photomultiplier tube spenninger å plassere G0/G1 topp i øvre høyre for midten på tomten for å tillate tilstrekkelig visning av den etterfølgende siden befolkningen. En del av S-fasen og hele G2 av cellesyklus kan være off-skala på øverst til høyre i plottet. Den blå sigNAL er relativt lys, mens den røde signalet er svakt. Typisk MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) spenninger er 425 for de blå og 650 for de røde.
- Døde celler er gated ut ved hjelp av PI. Standarden PI banen (eksitasjon 488nm, utslipp 630nm) kan brukes. Alternativt er PI også begeistret av UV laser og døde celler befolkning ligger utenfor skalaen på høyre side av side befolkningen (SP) plot. Dette letter behovet for å kompensere PI signal fra noen andre fluorochromes som FITC og PE. Den opprinnelige Goodell Metoden fulgt sistnevnte prosedyrene 5-7.
- Opprettholde et relativt lavt differansetrykk under analyse og sortering for å sikre tett oppløsning på siden befolkningen.
- SP ser ut som en side arm bortsett fra de viktigste populasjon av lungeceller. Denne populasjonen kalles Hoechst lav.
- Den Hoechst lav / SP er analysert for å skille CD45 positive og negative populasjoner med et histogram 2,3 (Figure 1).
- Følgende utvalg og gating av Hoechst lave CD45 neg lunge MSC befolkningen celler kan hentes ved å sortere enten som en blandet befolkning i et rør eller enkeltceller å isolere kloner i en 96-brønns plate 3.
- For plate sortering hva slags stream Nedbøyningen er justert til 25% for å skape en mer vertikal slags stream enn den som vanligvis brukes for tube sortering.
- Sikt den slags stream ved å sende en test strøm puls på øvre venstre og deretter nedre høyre godt av en 96-brønns plate.
- Sett sorter programvaren plate kartet for å sette ønsket antall celler i hver brønn.
- For å isolere enkelt celle kloner en enkelt lunge MSC er sortert i brønnen av en 96-brønns plate inn 150μl av kultur media (α-MEM supplert med 20% FBS). Etter den slags ytterligere 100μl av medium er lagt til.
5. Isolasjon, kultur og karakterisering av lunge MSC og Klonene
- Culture og utvidelse av blandet lunge MSC befolkning og enkelt celle kloner følgende sortering er identisk med standard kultur forhold (37 ° C, 5% CO 2 og> 95% luftfuktighet). Cellene er lov til å overholde følgende isolasjon i 16 timer. Media er byttet ut hver 48. time (α-MEM supplert med 20% FBS). Når cellene begynner å spre seg raskere og nå mellom 75-80% samløpet de er passaged (figur 2).
- Celler skylles med forvarmet HBSS og inkubert med 0,5% trypsin / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, katt # 25-053-Cl) ved 37 ° C for mindre enn 2 min. Cellene er overvåket ved hjelp av en invertert omfang for å bekrefte inntrykket av en celle suspensjon.
- Lung MSC blir deretter fordelt på forholdstall på 1:2 eller 1:3 avhengig av gjeldende spredning rate av kultur.
- Muligheten av lunge MSC å differensiere i tradisjonelle mesenchymale linjer av osteoblast, adipocyte og chondrocyttransplantasjon og deres celleoverflaten uttrykk akseptert mesenchymale markører ier evaluert for hver celle forberedelse. Cytogenetiske banding analyse er også utført for å bekrefte fraværet av brutto kromosomavvik 2,3,8-11.
Seks. Oppregning av lunge MSC bruker et Colony Forming analyse (CFU-F)
- Fortynnes celler i Komplett MesenCult medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) til en endelig konsentrasjon på 1x10 6 celler / ml.
- Utfør seriefortynning å oppnå endelig konsentrasjoner i en 100mm rett av 6x10 4 celler, 3x10 4 celler, 1,5 x10 4 celler og 0,75 x10 4 celler i 10ml av media. Analysene er utført i to eller tre eksemplarer for hver celle konsentrasjon og kan være skalert for mindre flater.
- Kultur celler i 10 dager under standard forhold. På dag 10 celler er skylt med PBS og fast med 100% metanol i 5 minutter ved romtemperatur.
- Oppdage CFU-F kolonier ved farging med 0,4% w / v Giemsa flekker løsning(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) fortynnes 1:20 med avionisert vann. La prøver å lufttørke og kvantifisere antall kolonier som inneholder mer enn 25 celler per koloni (figur 3).
7. Analyse av Immunmodulerende Properties av lunge MSC på T-celleproliferasjon og apoptose
- 6.25x10 4 lunge MSC celler per brønn er belagt i 96-brønn plater og lov til å stå over natten 2.
- CD4 + celler fra spleens av T-celle reseptor (TCR) transgene mus, OT-II med T-celler som gjenkjenner ovalbumin 323-339 peptid, blir renset ved å tappe CD8 +, CD19 +, MHC-II + og CD25 + celler med en Miltenyi AutoMACS celle sorter (Miltenyi, Auburn, CA). Antigenpresenterende celler (APC) er isolert av positivt sortering av MHC-II + celler 12.
- APC er fiksert i 4% Paraformaldehyde, vasket 3 ganger i PBS / 5% BSA/2mM EDTA, og lastet med 0.5μg/ml eller 5μg / ml OVA323 peptid.
- Simulert, vekst arrestert APC legges til lungene MSC i 96-brønn plater.
- Større enn 95% ren CD4 + 1x10 5 celler er merket med 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE, Sigma, St.Louis MO) i PBS og ruges i 5 min i mørket, vasket med PBS-5% BSA, og deretter lagt til APC og lunge MSC celler i DMEM 5% FBS media. Cellene blir deretter inkubert i 96 timer.
- T-cellene blir deretter farget med anti anti-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7); CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) og analyseres ved hjelp av en Miltenyi MacsQuant 7 kanal flowcytometer (Miltenyi, Aurburn, CA) og FloJo analyse programvare (Treestar, Ashland, OR). Spredning er målt som reduksjon i gjennomsnittlig fluorescerende intensitet CFSE forhold til bakgrunnen, T celler merket med CFSE og ikke utsettes for APC (Figur 4). T-cellene telles på denne tiden og levedyktighet vurderes med trypan blå eksklusjon.
8. Representant Resultater:
Figur 1. Flowcytometrisk analyse og definisjon av Lung MSC. Enkelt celle suspensjoner av lungevev fordøye er beiset med Hoechst 33342 og analysert ved flowcytometri å oppdage forskjeller i A. forover scatter (FSC) og side scatter (SSC) og B. Hoechst blå og rød fluorescens. Tilstedeværelsen av en side befolkningen (SP) er synlig i porten. Den Hoechst lave SP blir deretter analysert for å skille C. CD45 negative befolkningen i lunge MSC. Den CD45 positive til negative prosenter av lunge SP er typisk 70:30 / 60:40.
Figur 2. Isolering og Culture of Lung MSC. Etter samlingen av lungene MSC ved celle sortering, blir cellene belagt i 30mm retter med α-MEM supplemented med 20% FBS. A. Fersk sortert celler synes små, runde og lyse. B. Etter ca 2-3 uker kolonier med en mesenchymale fenotype bli tydelig og spredning er mer åpenbar.
Figur 3. Enumeration av MSC ved Colony Forming-fibroblast Assay. Utvidede lunge MSC er belagt per beskrevet protokoll for CFU-F analysen. A. Etter 10 dager og Giemsa beis kolonier er tydelig. B. Colonies er store, og består av en få hundre celler. C. Cellene viser en mesenchymale fenotype. A & B, Scale bar = 0,5 cm; C Scale bar = 0.14 cm.
Figur 4. CFSE Basert T-celleproliferasjon Assay. I fravær av lunge MSC og tilstedeværelse av antigen presentere celler (APC) + / - ovalbumin (OVA) CD40 positive effektor T celle viser en nedgang i CFSE intensitet som indikerer spredning (rød sirkel). CFSE fluorescensintensitet av T-cellemembranen avtar stoichiometrically med hver celledeling ie. med hver divisjon. I nærvær av lunge MSC, APC + / - OVA, CD40 positive effektor T-celle viser ingen signifikant endring i CFSE intensitet som indikerer en mangel på spredning (rød sirkel).
Discussion
Vi har tilpasset en metode opprinnelig brukt til å identifisere BM hematopoetiske celler å isolere en bestemt befolkning bosatt lunge MSC. Grunnet reproduserbarheten av isolasjon disse cellene ble deretter godt karakterisert som MSC. Deres opprinnelse er definert som bosatt i den voksne musen lunge (i motsetning til BM avledet) og en fenotypisk og molekylær profil dokumentert 2. Evnen til å gjentatte ganger isolere dette karakteriseres befolkningen gjør at videre studier av biologisk betydning og rolle i lungene MSC under vev homeostase og sykdom. Den siste definisjonen av denne pasientgruppen in vivo i både murine og menneskelige lunge vev forenkler utviklingen av en terapeutisk strategi rettet mot redning av endogene celler for å lette lunge reparasjon i løpet av skade og sykdom.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd til SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Ekstra støtte ble gitt av: DW: NIH RO1DK075013, DDK og Kleberg Foundation; den UCCC flowcytometrisystemer Core (NIH 5 P30 CA 46934-15), den UCCC Microarray kjernen (NCI P30 CA 46934-14).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P-5368 | |
| Hanks buffered salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30588.01 | |
| 0.2% Worthington type 2 collagenase | Worthington Biochemical | LS004202 | |
| Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| H–chst 33342 dye | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| CD45-APC | BD Biosciences | 559864 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 81845 | |
| a-MEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30265.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-069 | |
| 0.5% trypsin/EDTA | Cellgro | 25-053-Cl | |
| Complete MesenCult Medium | Stem Cell Technologies | 05511 | |
| 0.4% w/v Giemsa staining solution | Sigma-Aldrich | GS1L | |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% paraformeldehyde is diluted to 4% using PBS |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21888 |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Jun, D. H. The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation. STEM CELLS. , (2011).
- Martin, J. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).
- Majka, S. M. Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration. The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).
- Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. Basic Cell Culture Protocols. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).
- Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an. Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).
- Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).
- Chateauvieux, S. Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells. Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).
- Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation. Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).
- Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).
- Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).
- Waid, D. M. A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes. Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).
