13 C – النظائر الوسم هو تقنية مفيدة لتحديد استقلاب الخلية المركزية لمختلف أنواع الكائنات الحية الدقيقة. بعد أن تم مثقف الخلايا مع ركيزة محددة المسمى ، يمكن GC – MS قياس تكشف المسارات الأيضية الوظيفية استنادا إلى أنماط وسم فريدة من نوعها في الأحماض الأمينية proteinogenic.
الميكروبات والمسارات الأيضية المعقدة التي يمكن أن يتم التحقيق باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية وعلم الجينوم وظيفية. أسلوب واحد مهم لدراسة استقلاب الخلية المركزية واكتشاف الانزيمات الجديدة هو 13 C – 1 ساعدت تحليل الأيض. وتستند هذه التقنية على وضع العلامات النظائر ، حيث يتم تغذية الميكروبات مع ركائز المسمى C 13. من خلال تتبع مسارات الانتقال بين ذرة الأيضات في شبكة الكيمياء الحيوية ، ويمكننا تحديد مسارات وظيفية جديدة واكتشاف الانزيمات.
كوسيلة مكملة لtranscriptomics والبروتيوميات ، وأساليب isotopomer بمساعدة تحليل المسارات الأيضية تحتوي على ثلاث خطوات رئيسية 2. أولا ، نحن تنمو الخلايا مع ركائز المسمى C 13. في هذه الخطوة ، وتكوين وسيلة واختيار من ركائز المسمى هما عاملان رئيسيان. لتجنب الضوضاء القياس من الكربون غير المسمى في المكملات الغذائيةمطلوب وسيط مع الحد الأدنى من مصدر وحيد للكربون. علاوة على ذلك ، ويستند اختيار ركيزة المسمى على مدى فعالية سيكون توضيح المسار يجري تحليلها. لأن الانزيمات رواية مختلفة الفراغية غالبا ما تنطوي على رد فعل أو منتجات وسيطة ، بصفة عامة ، ركائز الكربون المسمى منفردة أكثر إفصاحا للكشف عن مسارات الرواية من تلك المسماة موحد للكشف عن مسارات الرواية 3 ، 4 ، وثانيا ، نقوم بتحليل الحمض الأميني أنماط العلامات باستخدام GC – MS. الأحماض الأمينية هي وفيرة من البروتين وبالتالي يمكن الحصول عليها من التحلل الكتلة الحيوية. يمكن أن الأحماض الأمينية التي كتبها N – derivatized (ثالثي butyldimethylsilyl) – N – methyltrifluoroacetamide (TBDMS) قبل فصل GC. يمكن أن تكون مجزأة الأحماض الأمينية TBDMS derivatized بواسطة MS والنتيجة في صفائف مختلفة من شظايا. استنادا إلى نسبة الكتلة (م / ض) تهمة من الأحماض الأمينية مجزأة وغير مجزأة ، يمكننا أن نستنتج أن أنماط المسمى ممكن من الأيضات المركزية التيالسلائف من الأحماض الأمينية ، وثالثا ، علينا تتبع التحولات الكربون 13C في المسارات المقترحة ، واستنادا إلى البيانات isotopomer ، تأكيد ما إذا كانت هذه المسارات هي 2 النشطة. قياس الأحماض الأمينية النظائر يوفر معلومات عن العلامات التجارية حوالي ثمانية الأيضات السلائف حاسما في عملية الأيض المركزية. يمكن لهذه العقد الأيضية الرئيسية تعكس مهام المسارات المركزية المرتبطة بها.
ويمكن تحليل عملية الأيض 13 C – ساعدت عبر proteinogenic الأحماض الأمينية المستخدمة على نطاق واسع لتوصيف وظيفي في استقلاب الجرثومية سيئة اتسمت 1. في هذا البروتوكول ، وسوف نستخدم Cyanothece 51142 لان السلالة نموذج للتدليل على استعمال الكربون من ركائز المسمى لاكتشاف وظائف جديدة الأنزيمية.
يتكون هذا البروتوكول للتغذية الخلية مع ركيزة وصفت وقياس الناتج أنماط العلامات النظائر في الأحماض الأمينية عبر GC – MS. منذ MS البيانات (م / ض النسب) تعطي فقط من المبلغ الإجمالي لوضع العلامات من الأيونات MS ، لدينا لتقييم توزيعات isotopomer من الأحماض الأمينية عن طريق فحص نسب م / …
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة شهادة NSF (MCB0954016) والطاقة الحيوية وزارة الطاقة بحوث غرانت (DEFG0208ER64694).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |