13 C-איזוטופ תיוג היא טכניקה יעילה לקביעת מטבוליזם התא מרכזי בסוגים שונים של מיקרואורגניזמים. אחרי תאים בתרבית כבר עם מצע שכותרתו ספציפיים, GC-MS המדידה יכול לחשוף מסלולים מטבוליים פונקציונלי המבוסס על דפוסי תיוג ייחודי חומצות אמינו proteinogenic.
חיידקים יש מסלולים מטבוליים מורכבים שניתן לחקור בשיטות הגנומיקה ביוכימיה תפקודית. אחת הטכניקות חשוב לבחון מטבוליזם התא המרכזי לגלות אנזימים חדשים היא 13 C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים 1. טכניקה זו מבוססת על תיוג איזוטופי, לפיה חיידקים ניזונים עם 13 ג שכותרתו מצעים. על ידי התחקות את המעבר בין הנתיבים אטום מטבוליטים ברשת ביוכימיים, אנו יכולים לקבוע מסלולים פונקציונלי לגלות אנזימים חדשים.
כפי שיטת משלים transcriptomics ו proteomics, גישות לניתוח isotopomer בסיוע של מסלולים מטבוליים מכילים שלושה שלבים עיקריים 2. ראשית, אנו לגדל תאים עם 13 ג שכותרתו מצעים. בשלב זה, את ההרכב של המדיום ואת הבחירה של מצעים שכותרתו הם שני גורמים מרכזיים. כדי למנוע רעשים מדידת פחמן הלא מסומן תוספי תזונה, מדיום מינימלי עם מקור הפחמן היחידי הנדרש. יתר על כן, הבחירה של מצע שכותרתו מבוססת על כמה יעיל זה יהיה להבהיר את מסלול להיות מנותח. בגלל האנזימים רומן לעתים קרובות כרוך stereochemistry תגובה אחרת או מוצרי ביניים, באופן כללי, מצעים פחמן שכותרתו ביחידים הם אינפורמטיבי יותר לאיתור מסלולים רומן מאלה שכותרתו אחיד לגילוי מסלולים הרומן 3, 4. שנית, אנו מנתחים את דפוסי חומצה אמינית תיוג באמצעות GC -MS. חומצות אמינו הן בשפע חלבון ולכן ניתן להשיג הידרוליזה ביומסה. חומצות אמינו ניתן derivatized על ידי N-(טרט-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) לפני ההפרדה GC. חומצות אמינו TBDMS derivatized יכול להיות מקוטעת על ידי MS והתוצאה במערכים שונים של שברים. בהתבסס על מסת יחס תשלום (m / z) של חומצות אמינו מקוטעת unfragmented, אנו יכולים להסיק את דפוסי שכותרתו אפשרית של מטבוליטים מרכזי, כי הםסימנים מקדימים של חומצות אמינו. שלישית, אנו מעברים עקבות הפחמן 13C את המסלולים המוצעים, בהתבסס על הנתונים isotopomer, לאשר מסלולים אלה הם 2 פעילים. מדידה של חומצות אמינו מספק מידע תיוג איזוטופי כשמונה מטבוליטים מבשר חיוני במטבוליזם המרכזי. אלה צמתים מרכזיים מטבולית יכול לשקף את הפונקציות של מסלולים מרכזיים הקשורים.
13 C-בסיוע ניתוח חילוף החומרים באמצעות חומצות אמינו proteinogenic יכול להיות בשימוש נרחב לאפיון פונקציונלי של חילוף החומרים של חיידקים גרוע מאופיינים 1. בפרוטוקול זה, נשתמש Cyanothece 51142 כמו מאמץ את המודל להדגים את השימוש מצעים פחמן שכותרתו לגילוי פונקציות האנזימטית חדש.
פרוטוקול זה כולל האכלה את התא עם המצע שכותרתו למדידת דפוסי כתוצאה תיוג איזוטופי של חומצות אמינו באמצעות GC-MS. מאז MS הנתונים (m / z יחסי) לתת בדיוק את הכמות הכוללת של תיוג של יונים MS, אנחנו צריכים להעריך את הפצות isotopomer של חומצות אמינו על ידי בחינת מ '/ z יחס של שני unfragmented (M-57…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי מענק קריירה NSF (MCB0954016) לבין מחקר Bioenergy DOE גרנט (DEFG0208ER64694).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |