Metabole route Bevestiging en Discovery door 13 C-etikettering van proteïnogene aminozuren
Summary
13 C-isotoop labeling is een nuttige techniek voor het bepalen van de cel centrale metabolisme voor verschillende soorten micro-organismen. Na de cellen zijn gekweekt met een specifiek gelabeld substraat, kunnen GC-MS metingen onthullen functionele metabole routes op basis van unieke patronen in de etikettering proteïnogene aminozuren.
Abstract
Microben hebben complexe metabole routes die kunnen worden onderzocht met behulp van de biochemie en functional genomics methoden. Een belangrijke techniek om cellen centrale metabolisme te onderzoeken en ontdekken nieuwe enzymen is 13 C-metabolisme ondersteunde analyse 1. Deze techniek is gebaseerd op de isotopische labeling, waarbij de microben worden gevoed met een 13 C gelabelde substraten. Door het opsporen van het atoom transitiepaden tussen metabolieten in de biochemische netwerk, kunnen we bepalen functionele paden en ontdek nieuwe enzymen.
Als een aanvullende methode om transcriptomics en proteomics, benaderingen voor isotopomeer-ondersteunde analyse van metabole routes bevatten drie belangrijke stappen 2. Ten eerste, we groeien cellen met 13 C gelabelde substraten. In deze stap is de samenstelling van het medium en de selectie van gelabelde substraten zijn twee belangrijke factoren. Om te voorkomen dat de meting geluiden van niet-gemerkte koolstof in voedingssupplementen, Is een minimaal medium met een enige koolstofbron nodig. Verder is de keuze van een gelabeld substraat op basis van hoe effectief het zal het pad wordt geanalyseerd toe te lichten. Omdat de nieuwe enzymen vaak gepaard met andere reactie stereochemie of halffabrikaten, in het algemeen, afzonderlijk gelabelde koolstofsubstraten zijn meer informatief voor de detectie van nieuwe wegen dan uniform label die voor de detectie van nieuwe wegen 3, 4. Ten tweede, analyseren we aminozuur etikettering patronen met behulp van GC -MS. Aminozuren zijn er in overvloed aan eiwitten en kan dus worden verkregen uit biomassa hydrolyse. Aminozuren kunnen gederivatiseerd worden door N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) voor GC scheiding. TBDMS gederivatiseerde aminozuren kan worden versnipperd door MS en resulteren in verschillende arrays van fragmenten. Op basis van de massa op te laden (m / z) verhouding van de gefragmenteerde en ongefragmenteerd aminozuren, kunnen we afleiden van de mogelijke label patronen van de centrale metabolieten die wordenvoorlopers van de aminozuren. Ten derde, we sporen 13C carbon overgangen in de voorgestelde paden en, op basis van de isotopomeer gegevens bevestigen of deze pathways actief zijn 2. Meting van aminozuren levert isotopische labeling informatie over de acht cruciale voorloper metabolieten in het centrale metabolisme. Deze metabole belangrijkste knooppunten kunnen weerspiegelen de functies van de geassocieerde landen in Midden paden.
13 C-metabolisme ondersteunde analyse via proteïnogene aminozuren op grote schaal kunnen worden gebruikt voor functionele karakterisering van slecht gekarakteriseerd microbiële metabolisme 1. In dit protocol, zullen we gebruik maken Cyanothece 51.142 als het model inspannen om het gebruik van gelabelde koolstof substraten voor het ontdekken van nieuwe enzymatische functies te demonstreren.
Protocol
Discussion
Dit protocol bestaat uit het voeden van de cel met een gelabeld substraat en het meten van de daaruit voortvloeiende isotopische labeling patronen in de aminozuren via GC-MS. Omdat MS-gegevens (m / z ratio's) geven gewoon het totale bedrag van de etikettering van MS-ionen, moeten we de isotopomeer verdelingen van aminozuren te beoordelen door onderzoek van de m / z ratio's van zowel de gefragmenteerde (M-57) + en gefragmenteerd aminozuren (dat wil zeggen, (M-159) + en (f302) +). …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door een NSF Career Grant (MCB0954016) en een DOE Bioenergy Research Grant (DEFG0208ER64694).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | – |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | – |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | – |
| GC Columns | J&W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | – |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | – |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18825 | For drying amino acid samples |
Riferimenti
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
- Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
- Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
- Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
- Wittmann, C. Fluxome analysis using GC-MS. Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).
- Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
- Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
- Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
- Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
- Tang, K. -. H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
- Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
- Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
- Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
- Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. , (2011).
- Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
- Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
- Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
- Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
- Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
- Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
- Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).
