MAME Modellen voor 4D live-cell imaging van de tumor: micro-omgeving interacties die van invloed zijn Maligne Progression
Summary
We hebben 3D coculture modellen voor live-cell imaging in real-time van de interacties tussen borsttumor cellen en andere cellen in hun micro-omgeving die van invloed zijn progressie naar een invasieve fenotype. Deze modellen kunnen dienen als preklinisch schermen voor drugs te paracriene-geïnduceerde proteolytische, chemokine / cytokine en kinase pathways die betrokken zijn bij invasiviteit richten.
Abstract
We hebben 3D coculture modellen, die we term MAME (m ammary een rchitectuur en m icroenvironment e ngineering), en ze gebruikt voor live-cell imaging in real-time van de cel: cel interacties. Onze algemene doel was om modellen die de architectuur van preinvasive laesies van borst om hun progressie te bestuderen om een invasieve fenotype recapituleren te ontwikkelen. In het bijzonder hebben we modellen ontwikkeld om de interacties tussen de pre-maligne borst epitheelcellen varianten en andere celtypes van de tumor micro-omgeving die zijn betrokken bij het verbeteren of het verminderen van de progressie van preinvasive borst epitheelcellen van invasieve ductale carcinomen te analyseren. Andere celtypen onderzocht tot nu toe zijn myo-cellen, fibroblasten, macrofagen en bloed-en lymfestelsel microvasculaire endotheelcellen. Naast de MAME modellen, die zijn bedoeld om de cellulaire interacties in de borst vatten tijdensde voortgang van kanker, hebben we vergelijkbare modellen voor de progressie van prostaatkanker.
Hier illustreren we de procedures voor het vaststellen van de 3D-cocultures samen met het gebruik van live-cell imaging en een functionele proteolyse test om de overgang van cocultures van de borst ductaal carcinoma in situ (DCIS) cellen en fibroblasten tot een invasieve fenotype loop van de tijd volgen, in dit geval over drieëntwintig dagen in kweek. De MAME cocultures bestaan uit meerdere lagen. Fibroblasten zijn ingebed in de onderste laag van type I collageen. Op die bevindt zich een laag van gereconstitueerde basaal membraan (RBM), waarop DCIS cellen worden gezaaid. Een laatste toplaag van 2% RBM is opgenomen en aangevuld met elke verandering van de media. Om het beeld proteolyse geassocieerd met een toename van een invasieve fenotype we kleurstof-gehard (DQ) fluorescerende matrixeiwitten (DQ-collageen I gemengd met de laag van collageen I en DQ-collageen IV gemengd met de middelste laag van rBM) en observeer levende culturen met behulp van confocale microscopie. Optische onderdelen worden vastgelegd, verwerkt en gereconstrueerd in 3D met Volocity visualisatie-software. In de loop van 23 dagen in MAME cocultures, de DCIS-cellen prolifereren en samenvloeien tot grote invasieve structuren. Fibroblasten migreren en opgenomen worden in deze invasieve structuren. Fluorescente proteolytische fragmenten van collageen zijn die samen met het oppervlak van DCIS structuren intracellulair, en gedispergeerd door de omgevende matrix. Geneesmiddelen die op proteolytische, chemokine / cytokine en kinase-routes of wijzigingen in de cellulaire samenstelling van de cocultures kan het invasieve verminderen, wat suggereert dat MAME modellen worden gebruikt preklinische schermen voor nieuwe therapeutische methoden.
Protocol
Discussion
Zoals blijkt kan de MAME cocultures worden gebruikt voor levende cellen beeldvorming in real-time van wisselwerking tussen de celbestanddelen een borsttumor en micro omvatten. In lopende studies in ons laboratorium gebruikten we MAME cocultures om proteolytische verbonden overgang van DCIS tot invasieve carcinoom, en de wisselwerking tussen proteolytische en andere routes die betrokken bij de overgang zoals chemokine / cytokine / groeifactor trajecten identificeren . We laten verder zien dat MAME-modellen kunnen worden …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund, voor een deel, door de National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS en RRM). Live-cell imaging werd uitgevoerd in de Microscopie, Imaging en Cytometry ondersteund Resources Core, gedeeltelijk door NIH Center subsidie P30 CA22453 aan de Karmanos Kanker Instituut, Wayne State University en door de Perinatologie Research afdeling van de National Institutes of Child Health and Development , Wayne State University.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) |
Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-col IV D12052 |
|
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific Co. | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza | MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 |
Phenol red–free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
Riferimenti
- Sameni, M., Dosescu, J., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol. Imaging. 2, 159-175 (2003).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr. Protoc. Cell Biol. 39, (2008).
- Jedeszko, C., Victor, B. C., Podgorski, I., Sloane, B. F. Fibroblast hepatocyte growth factor promotes invasion of human mammary ductal carcinoma in situ. Cancer Res. 69, 9148-9155 (2009).
- Sameni, M. Functional live-cell imaging demonstrates that beta1-integrin promotes type IV collagen degradation by breast and prostate cancer cells. Mol. Imaging. 7, 199-213 (2008).
- Li, Q. p21-activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. Neoplasia. 10, 314-328 (2008).
- Sameni, M. Imaging and quantifying the dynamics of tumor associated proteolysis. Clin. Exp. Metastasis. 26, 299-309 (2009).
- Cavallo-Medved, D. Live-cell imaging demonstrates that proteases in caveolae of endothelial cells degrade extracellular matrix. Exp. Cell. Res. 315, 1234-1246 (2009).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
