Modelos MAME para formação de imagens 4D Live-célula do tumor: Interações microambiente que a progressão de Impacto maligno
Summary
Nós desenvolvemos modelos 3D para co-cultura de células de imagem ao vivo em tempo real das interações entre as células tumorais de mama e outras células em seu microambiente que a progressão de impacto para um fenótipo invasivo. Estes modelos podem servir como telas pré-clínicos de medicamentos para atingir parácrina induzidas proteolíticas caminhos, quimiocinas / citocina e quinase envolvidos na invasão.
Abstract
Nós desenvolvemos modelos de co-cultura em 3D, que MAME prazo (m ammary um rchitecture e m icroenvironment ngineering e), e os usou para live-célula de imagem em tempo real da célula: interações celulares. Nosso principal objetivo foi desenvolver modelos que recapitulam a arquitetura das lesões mamárias pré-invasivo para estudar a sua progressão para um fenótipo invasivo. Especificamente, desenvolvemos modelos para analisar as interacções entre pré-malignas da mama variantes de células epiteliais e outros tipos de células de tumor que o microambiente têm sido implicados na melhoria ou reduzir a progressão de células de mama preinvasive epiteliais para carcinomas ductais. Outros tipos de células estudadas até à data são células mioepiteliais, fibroblastos, macrófagos e células do sangue e linfáticos microvasculares endoteliais. Além dos modelos Mame, que são concebidos para recapitular as interacções celulares dentro da mama duranteprogressão do câncer, desenvolvemos modelos comparáveis para a progressão do câncer de próstata.
Aqui temos ilustram os procedimentos para o estabelecimento das coculturas 3D, juntamente com a utilização de vivo de células de imagem e um ensaio de proteólise funcional a seguir a transição de coculturas de carcinoma da mama ductal di situ (CDIS) células e fibroblastos para um fenótipo invasivo ao longo do tempo, em Neste caso mais de vinte e três dias em cultura. O coculturas MAME consistem em camadas múltiplas. Os fibroblastos são incorporados na camada inferior de colagénio tipo I. Em que está colocada uma camada de membrana basal reconstituída (FRP) sobre o qual as células são semeadas DCIS. A camada final topo da RBM 2% incluído e repostos a cada mudança de mídia. Para a proteólise da imagem associada com a progressão para um fenótipo invasivo, usamos corante-temperados (DQ) proteínas fluorescentes matriz (dq-colagénio I misturado com a camada de colagénio I e DQ-colagénio IV misturado com a camada do meio de rBM) e observar culturas vivas utilizando microscopia confocal. Secções ópticas são capturados, processados e reconstruído em 3D com o software de visualização Volocity. Ao longo de 23 dias coculturas em MAME, as células DCIS proliferar e coalescer em grandes estruturas invasivos. Fibroblastos migram e se incorporaram essas estruturas invasivas. Fluorescentes fragmentos proteolíticos dos colagénios são encontrados em associação com a superfície de estruturas CDIS, intracelularmente, e também dispersa por toda a matriz circundante. Drogas que proteolítica alvo de quimiocinas, / citocina e quinase vias ou modificações na composição celular do coculturas pode reduzir a capacidade de invasão, sugerindo que os modelos de MAME pode ser usado como telas de pré-clínicos para novas abordagens terapêuticas.
Protocol
Discussion
Como demonstrado, o coculturas MAME pode ser usado para vivo de células de imagem em tempo real das interacções entre os vários constituintes celulares que compreendem um tumor da mama e do seu microambiente. Em estudos em curso no nosso laboratório, utilizou-se MAME coculturas para identificar vias proteolíticas associados com a transição de CDIS carcinoma ductal infiltrante, bem como as interacções entre as vias proteolíticas e outras vias envolvidas nesta transição, tais como as vias de quimiocina citoci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado, em parte, pelo National Institutes of Health R01 CA131990 (BFS e MRR). Live-célula de imagem foi realizado no Núcleo de Recursos imagens de microscopia, e Citometria suportado, em parte, pelo NIH Centro de concessão P30 CA22453 ao Karmanos Cancer Institute, Wayne State University e pelo Poder Pesquisa Perinatologia do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento , Wayne State University.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| Reconstituted basement membrane (Cultrex) | Trevigen | 3445-005-01 | Comparable to Matrigel (BD Biosciences) |
| Collagen I | Cohesion Laboratories | 5005-B | |
| DQ-substrates (collagen I, IV) |
Invitrogen | DQ-col I-D12060 DQ-col IV D12052 |
|
| 22-mm plastic coverslips | Fisher Scientific Co. | 12-547 | Cut in half, leave in 70% ethanol for 10 min and air-dry before use. |
| Cell culture medium | Lonza | MEBM-PRF CC-3153 MEGM CC-4136 |
Phenol red–free |
| ibiTreat μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Version 5.5 | Other brands of imaging software can be used to generate 3D reconstructions and movies. |
Riferimenti
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