إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP
Summary
وهناك طريقة لتوليد الإنسان الجذعية المحفزة التي يسببها الخلايا (iPSCs) عبر الارتجاعي بوساطة التعبير خارج الرحم من OCT4، يوصف SOX2، KLF4 وMYC. ويناقش أيضا وسيلة عملية لتحديد المستعمرات iPSC الإنسان على أساس التعبير GFP.
Abstract
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) متعددة الإمكانات ومصادر لا تقدر بثمن للخلوي في النمذجة مرض المختبر، والتجدد الطب 1. ولقد ثبت من قبل أنه يمكن إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية إلى تعدد القدرات بواسطة التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ الأربع (Oct4، Sox2، Klf4 وMyc)، وأصبح بفعل الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) 2-4. مثل hESCs، iPSCs الإنسان هي المحفزة ومصدرا محتملا للخلايا ذاتي. نحن هنا وصف بروتوكول لإعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع العوامل الأربعة المستنسخة إلى إعادة برمجة GFP المحتوية على العمود الفقري فيروسات 4. باستخدام بروتوكول التالية، ونحن توليد iPSCs الإنسان في 3-4 أسابيع تحت حالة الإنسان ثقافة ESC. الإنسان المستعمرات iPSC تشبه hESCs في التشكل وعرض الخسائر في مضان GFP نتيجة لإسكات التحوير فيروسات. المستعمرات iPSC معزولة ميكانيكيا تحت microsco مضانPE تتصرف بطريقة مشابهة كما hESCs. في هذه الخلايا، ونحن للكشف عن التعبير عن الجينات متعددة تعدد القدرات وعلامات سطح.
Protocol
Discussion
التعبير عن الخلايا الليفية النسخ 4 يعيد البرمجة العوامل البشرية إلى iPSCs. جرت محاولات عديدة لتوليد iPSCs الإنسان باستخدام أساليب غير دمج أو غير الجينية لتوليد iPSCs الآمنة سريريا. حتى الآن، هذه الأساليب تظهر كفاءة منخفضة للغاية وتتطلب التحسين إضافية لتحسين استنساخ 11-14.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل كلية الطب بجامعة ييل، وجائزة الطفل بحوث الصحية من مؤسسة تشارلز هود.
Materials
| Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
| hESC medium | |||
| DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
| Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
| L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
| Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
| β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
| bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
| Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
| Fiboblasts Medium | |||
| DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
| FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
| Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
| Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
| Antibodies | |||
| OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
| SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
| SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
| Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
| Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
| NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
| Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
| Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
| DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
| Plasmids | |||
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| Other Materials | |||
| Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
| Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
| Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
| Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
| BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
| MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter | |||
Table 2. Reagents and equipment.
Riferimenti
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Hotta, A., Ellis, J. Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states. Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).
- Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET. Nature. 464, 927-931 (2010).
- Wolf, D., Goff, S. P. Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs. Nature. 458, 1201-1204 (2009).
- Chan, E. M., Ratanasirintrawoot, S., Park, I. H., Manos, P. D., Loh, Y. H., Huo, H., Miller, J. D., Hartung, O., Rho, J., Ince, T. A. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27, 1033-1037 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, ., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).
- Wolf, D., Goff, S. P. TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells. Cell. 131, 46-57 (2007).
- Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).
