La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

Summary

Un método para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a través de retrovirus mediada por la expresión ectópica de Oct4, Sox2, Klf4 y MYC se describe. Una forma práctica para identificar las colonias de humanos IPSC basadas en la expresión de GFP también se discute.

Abstract

Las células madre embrionarias (hESCs) son pluripotentes y una fuente inestimable para celulares en el modelado de la enfermedad in vitro y la medicina regenerativa ^1. Se ha demostrado previamente que las células somáticas humanas pueden ser reprogramadas para pluripotencia por la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y Myc) y se convierten en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) ^2-4. Al igual que hESCs, iPSCs humanos son pluripotentes y una fuente potencial de células autólogas. A continuación se describe el protocolo de reprogramar las células de fibroblastos humanos con los cuatro factores de reprogramación clonados en las buenas prácticas agrarias que contienen columna vertebral de retrovirales ^4. Utilizando el protocolo siguiente, generamos iPSCs humanos en 3-4 semanas bajo condiciones de la cultura humana ESC. Humanos colonias IPSC se parecen mucho a hESCs en la morfología y mostrar la pérdida de la fluorescencia de GFP como resultado de silenciamiento de transgenes retrovirales. colonias aisladas IPSC mecánicamente bajo una fluorescencia microscópicaPE se comportan de una manera similar como hESCs. En estas células, se detecta la expresión de múltiples genes pluripotencia y marcadores de superficie.

Protocol

1. Reprogramación por retrovirus Expresando factores de reprogramación Fibroblastos humanos se cultivaron en medio de fibroblastos (10% de FBS en DMEM con Pen / Strep). Un día antes de la infección, la placa de 1×10 5 fibroblastos humanos en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Aspirar el medio para eliminar las células muertas y añadir 2 ml de medio de fibroblastos fresco. Añadir sulfato de protamina a una concentración final de 5 mg / ml. Añadir cuidadosam…

Discussion

Expresión de los cuatro factores de transcripción reprograma fibroblastos humanos a iPSCs. Muchos intentos se hicieron para generar iPSCs humanos utilizando los enfoques no integrar o no genéticos para generar iPSCs clínicamente seguros. Hasta ahora, estos métodos presentan una eficiencia extremadamente baja y requieren una mayor optimización para mejorar la reproducibilidad ^11-14. Métodos de retro-o lentiviral son fácilmente utilizados para obtener y aplicar iPSCs para personas en modelos de…

Materials

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
hESC medium
DMEM/F12	80%	Invitrogen	11330057
Knockout Serum Replacer	20%	Invitrogen	10828-028
L-Glutamine (200 mM)	2 mM	Invitrogen	25030081
Nonessential Amino Acids (10 mM)	0.1 mM	Invitrogen	11140050
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG	0.1 mM	Invitrogen	M-6250
bFGF-2 10 μg/ml	4 ng/ml	GIBCO/BRL	GF003AF
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122
Fiboblasts Medium
DMEM	90%	Invitrogen	11965118
FBS	10%	Invitrogen	10407028
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122

Table 1. Culture Medium

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
Antibodies
OCT4	1:500	Abcam	Ab19857
SSEA3	1:100	Milipore	MAB4303
SSEA4	1:100	BD Biosciences	BD560218
Tra-1-81	1:100	BD Biosciences	BD560173
Tra-1-60	1:100	BD Biosciences	BD560174
NANOG	1:500	Abcam	Ab21624
Alexa-Flur 488	1:1000	Invitrogen	A11008
Alexa-Flur 555	1:1000	Invitrogen	A21422
DAPI	1:5000	Invitrogen	D1306
Plasmids
pMIG-OCT4		Addgene	17225
pMIG-SOX2		Addgene	17226
pMIG-KLF4		Addgene	17227
pMIG-MYC		Addgene	18119
Other Materials
Collagenase type IV	1mg/ml	Invitrogen	17104019
Gelatin, Porcine	0.1%	Sigma	G 1890
Triton	0.2%	Sigma	X100-500ML
Paraformaldehyde	4%	Sigma	47608
BSA	3%	American Bioanalytical	AB01800
MEF feeder cells		Millipore	PMEF-N
Cell Lifter		Corning	3008
Equipment
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter

Table 2. Reagents and equipment.