Un metodo per generare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) tramite retrovirus-mediata espressione ectopica di Oct4, Sox2, Klf4 e MYC è descritto. Un modo pratico per identificare umani IPSC colonie sulla base di GFP è anche discusso.
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Articolo metodologico
Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule staminali embrionali umane (hESC) sono pluripotenti e una fonte inestimabile per cellulari in vitro modelli di malattia e della medicina rigenerativa 1. E 'stato precedentemente dimostrato che cellule somatiche umane può essere riprogrammato per pluripotenza dall'espressione ectopica di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4 e Myc) e diventare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) 2-4. Come hESC, iPSCs umani sono pluripotenti e una fonte potenziale di cellule autologhe. Qui descriviamo il protocollo per riprogrammare cellule di fibroblasti umani con i quattro fattori di riprogrammazione clonati in GFP-retrovirale contenente backbone 4. Utilizzando il seguente protocollo, generiamo iPSCs umani in 3-4 settimane sotto condizione umana della cultura ESC. Umani colonie IPSC assomigliano hESC nella morfologia e visualizzare la perdita di fluorescenza GFP come risultato di silenziamento del transgene retrovirale. colonie IPSC isolato meccanicamente con un microsco fluorescenzape si comportano in modo simile a come hESC. In queste cellule, si rileva l'espressione di geni multipli pluripotenziali e marcatori di superficie.
Protocollo
1. Riprogrammazione da Retrovirus Esprimere Fattori Riprogrammazione
- Fibroblasti umani vengono coltivate in mezzo di fibroblasti (10% FBS in DMEM con Pen / Strep).
- Un giorno prima dell'infezione, piastra 1x10 5 fibroblasti umani in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti.
- Aspirare il terreno per eliminare le cellule morte e aggiungere 2 ml di terreno di fibroblasti fresco. Aggiungere protammina solfato ad una concentrazione finale di 5 pg / ml.
- Cautela aggiungere la quantità appropriata di ciascun GFP-esprime virus corrispondente ad una molteplicità di infezione (MOI) 5 5.
- Un giorno dopo l&....
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Discussione
Espressione di quattro fattori di trascrizione riprogramma i fibroblasti umani a iPSCs. Molti tentativi sono stati fatti per generare iPSCs umani utilizzando non-integrazione o non-genetica approcci per generare iPSCs clinicamente sicuro. Finora, questi metodi presentano efficienza estremamente bassa e richiedono ulteriore ottimizzazione per migliorare la riproducibilità 11-14. Metodi Retro-o lentivirali sono facilmente utilizzati per ricavare e applicare iPSCs per l'uomo in modelli di malattia <.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Yale School of Medicine e Salute Child Research Award da Charles Hood Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330057 | 80% |
| Sostituto del siero Knockout | Invitrogen | 10828-028 | 20% |
| L-Glutammina (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | 2 mM |
| Aminoacidi non essenziali (10 mM) | Invitrogen | 11140050 | 0,1 mM |
| β-Mercapt–etanolo (14,3 M) o MTG | Invitrogen | M-6250 | 0,1 mM |
| bFGF-2 10 μg/ml | GIBCO, by Life Technologies | GF003AF | 4 ng/ml |
| Penicillina/Streptomicina | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| DMEM | Invitrogen | 11965118 | 90% |
| FBS | Invitrogen | 10407028 | 10% |
| Penicillina/Streptomicina | EMD Millipore | 15140-122 | 1% |
| Tabella 1. Mezzo di coltura | |||
| OCT4 | Abcam | Ab19857 | 1:500 |
| SSEA3 | EMD Millipore | MAB4303 | 1:100 |
| SSEA4 | BD Biosciences | BD560218 | 1:100 |
| Tra-1-81 | BD Biosciences | BD560173 | 1:100 |
| Tra-1-60 | BD Biosciences | BD560174 | 1:100 |
| NANOG | Abcam | Ab21624 | 1:500 |
| Alexa-Flur 488 | Invitrogen | A11008 | 1:1000 |
| Alexa-Flur 555 | Invitrogen | A21422 | 1:1000 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:5000 |
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| Collagenasi tipo IV | Invitrogen | 17104019 | 1 mg/ml |
| Gelatina, suina | Sigma-Aldrich | G 1890 | 0,1% |
| Triton | Sigma-Aldrich | X100-500ML | 0,2% |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 47608 | 4% |
| BSA | American Bioanalytical | AB01800 | 3% |
| Cellule MEF come cellule nutrici | EMD Millipore | PMEF-N | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Microscopia a fluorescenza: microscopio invertito con filtro GFP | |||
| Tabella 2. Reagenti e attrezzature |
Riferimenti
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S.
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