GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする
Summary
OCT4、SOX2、KLF4とMYCのレトロウイルス媒介性異所性発現を介してヒトの人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成する方法が記載されている。 GFP発現に基づいて人間のIPSCコロニーを識別するための実用的な方法についても説明されています。
Abstract
ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞） のin vitro疾患モデルと再生医療1 のための多能性と非常に貴重な細胞の源である。それは以前にヒト体細胞は、4つの転写因子の異所性発現（Oct4の、レトロウイルスベクター、KLF4及び Myc）によって多能性を再プログラムすることができることを示して誘導多能性幹細胞（性IPSC）2-4になっています。ヒトES細胞と同様に、人間性IPSCは、多能性と自己細胞の潜在的な源である。ここでは、GFPを含有するレトロウイルスバックボーン4にクローン化された4初期化因子によるヒト線維芽細胞を再プログラムするためのプロトコルについて説明します。以下のプロトコルを使用して、我々は、ヒトESCを培養条件下で3〜4週間で人間性IPSCを生成します。人間のIPSCのコロニーが密接に形態の似ているヒトES細胞とレトロウイルスのジーンサイレンシングの結果、GFP蛍光の損失を表示します。蛍光microscoの下に機械的に隔離されたIPSCのコロニーPEは、ヒトES細胞と同様の方法で動作します。これらの細胞では、我々は、複数の多能性遺伝子と表面マーカーの発現を検出することができます。
Protocol
1。初期化因子を発現するレトロウイルスによるプログラミングヒト線維芽細胞は線維芽細胞の培地（10％ペン/連鎖球菌を含むDMEM中でFBS）で培養されています。 6ウェルプレートの1ウェルに感染する前に、一日は、プレート1×10 5、ヒト線維芽細胞。 死んだ細胞を除去し、新鮮な線維芽細胞の培地2mlを追加するには、培地を吸引除去する。 5μg/ mlの最終濃度で硫?…
Discussion
性IPSCの4つの転写因子の発現は、ヒト線維芽細胞を再プログラムします。多くの試みが臨床的に安全性IPSCを生成するために、非積分または非遺伝的アプローチを用いてヒトの性IPSCを生成するために行われました。これまでのところ、これらのメソッドは非常に低い効率を示し、再現性11月14日を向上させるためにさらに最適化する必要があります。レトロまたはレンチウイルスの方法…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、チャールズ·フッド財団からの医学、母子保健研究賞のイェール大学によって資金を供給された。
Materials
| Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
| hESC medium | |||
| DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
| Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
| L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
| Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
| β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
| bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
| Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
| Fiboblasts Medium | |||
| DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
| FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
| Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
| Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
| Antibodies | |||
| OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
| SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
| SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
| Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
| Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
| NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
| Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
| Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
| DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
| Plasmids | |||
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| Other Materials | |||
| Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
| Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
| Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
| Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
| BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
| MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter | |||
Table 2. Reagents and equipment.
Riferimenti
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Hotta, A., Ellis, J. Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states. Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).
- Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET. Nature. 464, 927-931 (2010).
- Wolf, D., Goff, S. P. Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs. Nature. 458, 1201-1204 (2009).
- Chan, E. M., Ratanasirintrawoot, S., Park, I. H., Manos, P. D., Loh, Y. H., Huo, H., Miller, J. D., Hartung, O., Rho, J., Ince, T. A. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27, 1033-1037 (2009).
- Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, ., Thomson, J. A. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).
- Wolf, D., Goff, S. P. TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells. Cell. 131, 46-57 (2007).
- Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).
Tags
ReprogrammingHuman Somatic CellsInduced Pluripotent Stem CellsRetroviral VectorGFPHuman Embryonic Stem CellsPluripotentIn Vitro Disease ModelingRegenerative MedicineTranscription FactorsOct4Sox2Klf4MycAutologous CellsFibroblast CellsGFP-containing Retroviral BackboneESC Culture ConditionMorphologyRetroviral Transgene SilencingFluorescence MicroscopePluripotency GenesSurface Markers
Citazione di questo articolo
Kim, K., Hysolli, E., Park, I. Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP. J. Vis. Exp. (62), e3804, doi:10.3791/3804 (2012).