كفاءة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية
Summary
قمنا بتطوير بروتوكول جديد لتحسين كفاءة المختبر في تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية. حصلت على خلايا ES متباينة الخلايا العصبية الحركية يتميز كما يتضح من التعبير عن علامات الخلايا العصبية الحركية والخلايا العصبية باستخدام تقنيات المناعى.
Abstract
تمايز الخلايا الجنينية مباشرة من (ES) الجذعية إلى الخلايا العصبية الحركية وظيفي يمثل مورد واعدة لدراسة آليات المرض، لفحص مركبات عقار جديد، وتطوير علاجات جديدة لأمراض الخلايا العصبية الحركية مثل ضمور العضلات الشوكي (SMA) والتصلب الجانبي ( ALS). البروتوكولات الحالية العديد من استخدام مزيج من حمض الريتينويك (RA)، والقنفذ الصوتي (SHH) لتمييز الماوس الجذعية الجنينية (MES) الخلايا في الخلايا العصبية الحركية 1-4. ومع ذلك، فقد اجتمع كفاءة تمايز الخلايا زارة التربية والعلم في الخلايا العصبية الحركية فقط مع نجاح معتدل. قمنا بتطوير بروتوكول تمايز على مرحلتين (5) التي تحسن كبير في كفاءة التمايز مقارنة مع البروتوكولات المعمول بها حاليا. فإن الخطوة الأولى هي لتعزيز عملية neuralization بإضافة رأس وعوامل نمو الخلايا الليفية (FGFs). رأس هو بروتين مخلق العظام (BMP) وخصم متورطة في تحريض العصبية 1ccording إلى النموذج الافتراضي لتكوين الخلايا العصبية والنتائج في تشكيل الزخرفة العصبية الأمامية 6. جمعية جيل المستقبل مما يشير يعمل بالتآزر مع رأس في حفز تشكيل الأنسجة العصبية من خلال تعزيز الهوية الخلفي العصبية 7-9. في هذه الخطوة، ومعبي الخلايا زارة التربية والعلم مع رأس، bFGF، وجمعية جيل المستقبل 8 لمدة يومين لتعزيز التمايز نحو الأنساب العصبية. والخطوة الثانية هي للحث على العصبون الحركي المواصفات. وحضنت رأس / FGFs تتعرض الخلايا زارة التربية والعلم من التهاب المفاصل الروماتويدي، وناهض SHH، ناهض Smoothened (SAG)، لمدة 5 أيام لتسهيل العصبون الحركي جيل. لرصد التمييز بين فوضى في الخلايا العصبية الحركية، وكنا على خط خلية ES مستمدة من eGFP الماوس المعدلة وراثيا التعبير تحت سيطرة المروج الخلايا العصبية الحركية محددة Hb9 1. باستخدام هذا البروتوكول قوي، حققنا 51 ± 0.8٪ من كفاءة التمايز (ن = 3؛ ف <0.01، الطالب في اختبار t) 5. نتائج من مناعيوأظهرت أن تلطيخ GFP + الخلايا التعبير عن الخلايا العصبية الحركية علامات محددة، وجزيرة 1 والكولين أسيتيل (الدردشة). بروتوكول لدينا تمايز على مرحلتين ويوفر وسيلة فعالة للتمييز بين الخلايا زارة التربية والعلم في الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري.
Protocol
Discussion
نوعية الخلايا زارة التربية والعلم هو المعلمة الأكثر أهمية بالنسبة لجيل من كفاءة الخلايا العصبية الحركية. ويجب أن زراعة الخلايا زارة التربية والعلم في PMEF لمنع التمييز عفوية. بالإضافة إلى ذلك من LIF يساعد في الحفاظ على خلايا زارة التربية والعلم في حالة غير متمايزة. كما ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتكرس هذه المخطوطة لذكرى الدكتور Wenlan وانغ الذي وافته المنية يوم 26 مايو، 2011. نشكر الدكتور دوغلاس كير لتوفير بسخاء HBG3 الخلايا زارة التربية والعلم المستخدمة في هذه الدراسة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل Nemours، منحة (2 RR016472-10) في إطار برنامج INBRE من المركز الوطني للبحوث الموارد (NCRR)، وجائزة المنحة كوبر من NCRR (5 P20 RR020173-05) لدعم مركز طب الأطفال في مستشفى بحوث ألفريد دوبون الأول للأطفال، ويلمنجتون في ديلاوير، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
Riferimenti
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
