Efficiënte Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de motorische neuronen
Summary
We ontwikkelden een nieuw protocol om de efficiëntie van de in vitro differentiatie van muis embryonale stamcellen in motorneuronen te verbeteren. De gedifferentieerde ES-cellen verworven motorische neuronen heeft, zoals blijkt uit de expressie van neuronale en motor neuron markers met behulp van immunohistochemische technieken.
Abstract
Direct differentiatie van embryonale stamcellen (ES cellen) in functionele motorische neuronen een veelbelovende bron van de ziekte mechanismen te bestuderen, nieuwe medicijnen verbindingen te screenen, en om nieuwe therapieën voor motor neuron ziekten zoals spinale musculaire atrofie (SMA) en amyotrofische laterale sclerose te ontwikkelen ( ALS). Veel van de huidige protocollen maken gebruik van een combinatie van retinoïnezuur (RA) en sonic hedgehog (Shh) om de muis embryonale stamcellen (MES) cellen differentiëren tot neuronen 1-4. Echter, de differentiatie efficiëntie van MES cellen in motorische neuronen alleen een ontmoeting met matig succes. We hebben een twee-staps differentiatie protocol nr. 5 die aanzienlijk de differentiatie-efficiency verbetert in vergelijking met de huidige vastgestelde protocollen. De eerste stap is om de neuralization proces te versterken door het toevoegen van Noggin en fibroblast groeifactoren (FGF). Noggin is een bot morfogenetisch proteïne (BMP) antagonist en is betrokken bij neurale inductie eenolgens het standaard model van de neurogenese en resulteert in de vorming van de voorste neurale patronen 6. FGF-signalering werkt synergetisch met Noggin in het induceren van zenuwweefsel vorming door het bevorderen van een posterior neurale identiteit 7-9. In deze stap, werden cellen MES voorbehandeld met Noggin, bFGF, en FGF-8 twee dagen differentiatie bevorderen richting neurale lijnen. De tweede stap is het induceren van motorneuron specificatie. Noggin / FGF blootgesteld MES cellen werden geïncubeerd met RA en een Shh agonist, gladgestreken agonist (SAG), nog 5 dagen om de motor neuron generatie te vergemakkelijken. Om de differentiatie van MESs volgen in motorische neuronen, hebben we gebruik gemaakt van een ES-cellijn afgeleid van een transgene muis te drukken eGFP onder de controle van de motor neuron-specifieke promoter Hb9 1. Met behulp van deze robuuste protocol, behaalden we 51 ± 0,8% van differentiatie efficiëntie (n = 3, p <0,01, Student's t-test) 5. Resultaten van immunofluorescentiekleuring toonde aan dat GFP +-cellen van de motor neuron specifieke markers, Islet-1 en choline acetyltransferase (ChAT) uit te drukken. Onze twee-staps differentiatie-protocol zorgt voor een efficiënte manier om MES-cellen differentiëren in spinale motorische neuronen.
Protocol
Discussion
De kwaliteit van de MES-cellen is de meest kritische parameter voor een efficiënte productie van motorische neuronen. MES cellen moeten worden geteeld op PMEF om spontane differentiatie te voorkomen. Toevoeging van LIF helpt om de MES-cellen in een ongedifferentieerde toestand. Als MES cellen delen elke 12-15 uur, het kweekmedium wordt snel uitgeput en moet dagelijks worden vervangen.
Efficiënte activering van de Shh traject is een kritische parameter nodig motorneuron specificatie inducer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit manuscript is opgedragen aan de nagedachtenis van Dr Wenlan Wang overleden op 26 mei 2011. Wij danken dr. Douglas A. Kerr voor ruim het verstrekken van de HBG3 MES cellen die worden gebruikt in deze studie. Dit werk werd gefinancierd door Nemours, een subsidie (2 RR016472-10) onder de INBRE programma van het National Center for Research Resources (NCRR), en een Cobre toekennen van subsidies uit het NCRR (5 P20 RR020173-05) naar het Centrum te ondersteunen voor Pediatric Research in het Alfred I. du Pont Hospital for Children, Wilmington, Delaware, USA.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
Riferimenti
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
