Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Summary

Microscopia Multiphoton de órgãos inteiros de rato é possível através opticamente limpando o órgão antes de imagem, mas nem todos os protocolos de preservar o sinal de fluorescência de proteínas fluorescentes. Usando um método de compensação óptica com base de etanol a desidratação e álcool benzílico: benzil benzoato de compensação, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de cérebro de rato inteiro expressando YFP.

Abstract

Microscopia Multiphoton de geração de fluorescência intrínseca e segunda harmónica (SHG) de órgãos inteiros de rato é possível graças opticamente limpeza do órgão, antes de imagem. ^1,2 No entanto, para os órgãos que contêm proteínas fluorescentes, tais como GFP e YFP, protocolos de compensação ópticos que usam metanol desidratação e clara usando álcool benzílico: benzoato de benzila (BABB) enquanto desprotegido de ³ luz não preservam o sinal fluorescente. O protocolo aqui apresentado é uma nova forma em que para realizar compensação órgão inteiro óptico no cérebro do rato, preservando o sinal de fluorescência de YFP expressa em neurónios. A modificação do protocolo de compensação óptica de tal modo que o órgão é desidratado usando uma série graduada de etanol foi encontrada para reduzir os danos para as proteínas fluorescentes e preservar o seu sinal fluorescente para imagiologia multifotônica. ⁴ Utilizando um método optimizado de compensação óptica com base de etanol e de desidratação desmatamento por BABBenquanto protegida da luz, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de proteína fluorescente amarela expressão (YFP), nos neurónios do cérebro de um rato mais de 2 mm abaixo da superfície do tecido.

Protocol

1. Perfusão Animal 5 e Compensação cérebro inteiro Rato O comprimento total do procedimento podem variar, dependendo do período de tempo utilizado por passo de desidratação, no total, mas de todo o processo pode ser conduzido em dois dias. Pesar ratos YFP e em seguida profundamente anestesiar com uma injecção intraperitoneal de cetamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). Confirmar um plano cirúrgico de anestesia profunda antes de prosseguir para a cirurgia. Verifiqu…

Discussion

Enquanto padrão corantes orgânicos são compatíveis com uma variedade de solventes orgânicos, e, portanto, não representam um desafio especial para limpar os protocolos, as proteínas fluorescentes são menos tolerantes a mudanças em solvente. ⁴ O objetivo do presente trabalho foi o de superar uma séria limitação ópticos anteriores protocolos de compensação onde fluorescência de XFPs foi perdida ou seriamente prejudicado. As imagens que são aqui apresentados demonstram que a fluorescência de YF…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, Inc.	D8537	500 ml, pH 7.2
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde
Ethyl alcohol	American Bioanalytical	AB00515-00500	500 ml, 200 proof
Ethyl alcohol	Pharmco Products, Inc.	111000190	1 gal., 190 proof
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich, Inc.	402834	500 ml, 99+%
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich, Inc.	B6630-IL	500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA objective	Nikon	AZ Plan Flour 5X	15 WD