Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Summary

Microscopía multifotónica de órganos enteros de ratón es posible por ópticamente despejar el órgano antes de formación de imágenes, pero no todos los protocolos de preservar la señal fluorescente de proteínas fluorescentes. El uso de un método de compensación óptica con base de etanol y alcohol bencílico deshidratación: bencil benzoato de compensación, se muestran imágenes de alta resolución multifotónica de cerebro de ratón que expresa toda YFP.

Abstract

Microscopía multifotónica de generación armónica fluorescencia intrínseca y segundo (SHG) de órganos enteros de ratón se hace posible por ópticamente despejar el órgano antes de formación de imágenes. ^{1,2 Sin} embargo, para los órganos que contienen las proteínas fluorescentes como GFP y YFP, protocolos ópticos de compensación que utilizan metanol deshidratación y clara usando bencil alcohol: benzoato de bencilo (BABB), mientras que no protegido de la luz ³ no preservan la señal fluorescente. El protocolo presentado aquí es una forma novedosa en la que realizar todo el órgano de compensación óptica en cerebro de ratón preservando al mismo tiempo la señal de fluorescencia de YFP expresan en las neuronas. Alterar el protocolo de intercambio de información óptica de tal manera que el órgano se deshidrata mediante una serie de etanol se ha encontrado para reducir el daño a las proteínas fluorescentes y preservar su señal fluorescente para formación de imágenes multifotónica. ⁴ Usando un método optimizado de compensación óptica con base de etanol y deshidratación cobro por parte BABBmientras protegida de la luz, se muestran imágenes de alta resolución multifotónica de proteína amarilla fluorescente (YFP) de expresión en las neuronas del cerebro de un ratón de más de 2 mm por debajo de la superficie del tejido.

Protocol

1. Animal perfusión 5 y Compensación Total de cerebro de ratón La longitud total del procedimiento pueden variar dependiendo de la duración de tiempo utilizado por cada etapa de deshidratación, pero en total todo el proceso puede llevarse a cabo en dos días. Pesar ratones YFP y luego profundamente anestesiar con una inyección intraperitoneal de ketamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). Confirmar un plano quirúrgico de anestesia profunda antes de proceder a la cirug?…

Discussion

Mientras estándar colorantes orgánicos son compatibles con una amplia gama de disolventes orgánicos, y por lo tanto no suponen un reto particular para la limpieza de los protocolos, las proteínas fluorescentes a menudo son menos tolerantes a los cambios en el disolvente. ⁴ El objetivo del presente trabajo fue superar una limitación seria de anteriores protocolos de compensación óptica donde se perdió la fluorescencia de XFPs o gravemente degradada. Las imágenes que se presentan demuestran que la fluo…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, Inc.	D8537	500 ml, pH 7.2
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde
Ethyl alcohol	American Bioanalytical	AB00515-00500	500 ml, 200 proof
Ethyl alcohol	Pharmco Products, Inc.	111000190	1 gal., 190 proof
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich, Inc.	402834	500 ml, 99+%
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich, Inc.	B6630-IL	500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA objective	Nikon	AZ Plan Flour 5X	15 WD