Chromatine Isolatie door RNA-zuivering (Chirp)

Summary

Chirp is een nieuwe en snelle techniek om genomische bindingsplaatsen van niet-coderende RNA's lang (lncRNAs) in kaart te brengen. De methode maakt gebruik van de specificiteit van anti-sense oligonucleotiden tegels aan de lijst van lncRNA-gebonden genomische locaties mogelijk te maken.

Abstract

Lang niet-coderende RNA's zijn belangrijke regulatoren van chromatine staten voor belangrijke biologische processen, zoals de dosering compensatie, imprinting, en ontwikkelingsstoornissen genexpressie ^{1,2,3,4,5,6,7.} De recente ontdekking van duizenden lncRNAs in samenwerking met specifieke chromatine modificatie complexen, zoals Polycomb Repressieve Complex 2 (PRC2) die bemiddelt histon H3 lysine 27 trimethylering (H3K27me3), brede rollen voor tal van lncRNAs in het beheren van chromatine staten in een gen-specifieke suggereert mode ^8,9. Terwijl sommige lncRNAs worden verondersteld om te werken in cis op naburige genen, andere lncRNAs werken in trans naar de verte gelegen genen reguleren. Bijvoorbeeld, Drosophila lncRNAs roX1 en roX2 binden tal van regio's op het X-chromosoom van mannelijke cellen, en zijn van cruciaal belang voor de dosering compensatie ^10,11. Echter, de exacte locaties van hun bindingsplaatsen niet bekend met een hoge resolutie. Ook de menselijke lncRNA Hotair kan PRC2 bezetting van invloed zijn op hundreds van genen genoom-brede ^3,12,13, maar hoe specificiteit wordt bereikt, is onduidelijk. LncRNAs kan ook dienen als modulaire steigers voor de samenstelling van verschillende eiwitcomplexen te werven. De klassieke trans-werkende RNA-steiger is de TERC RNA dat dient als de sjabloon en steiger voor het telomerase complex ^14; Hotair kan ook dienen als een platform voor PRC2 en een H3K4 demethylase complex ^13.

Eerdere studies mapping RNA bezettingsgraad van chromatine gebleken aanzienlijke inzichten ^15,16, maar alleen op een locus met genen voor een. De bezettingsgraad sites van de meeste lncRNAs zijn niet bekend, en de rollen van lncRNAs in chromatine verordening zijn vooral afgeleid uit de indirecte effecten van de lncRNA verstoring. Net zoals chromatine immunoprecipitatie gevolgd door middel van microarray of diep-sequencing (chip-chip of chip-seq, respectievelijk) is sterk ons ​​begrip van eiwit-DNA interacties op een genomische schaal verbeterd, hier hebben we illustreren een recentgevoerd gepubliceerde strategie op de lange RNA genoom-brede bezetting in kaart te brengen met een hoge resolutie ^17. Deze methode, chromatine Isolatie van RNA-zuivering (Chirp) (figuur 1), is gebaseerd op affiniteit vangst van de beoogde lncRNA: chromatine complex door tegels antisense-oligo's, die vervolgens een kaart van genomische bindingsplaatsen genereert met een resolutie van enkele honderden bases met hoge gevoeligheid en weinig achtergrond. Chirp is voor vele lncRNAs omdat het ontwerp van affiniteit-probes is eenvoudig aangezien de RNA sequentie en vereist geen kennis van de structuur van de RNA of functionele domeinen.

Protocol

1. Probe-ontwerp Ontwerp anti-sense DNA-tegels probes voor selectieve ophalen van RNA-doelwit door Chirp. Ontwerp anti-sense oligo-probes met behulp van de online sonde ontwerper bij singlemoleculefish.com 18. Gebruik deze parameters: aantal sondes = 1 probe / 100 bp van RNA lengte, 2) Target GC% = 45, 3) Oligonucleotide lengte = 20; 4) Afstand lengte = 60-80. Breek RNA in segmenten als er te lang voor de ontwerper. Laat gebieden herhaalt of uitgebreide homologie. Bestel anti-sense DNA-probes met BiotinTEG op 3-prime end. Label probes volgens de posities langs het RNA. Scheid ze in twee zwembaden, zodat de "even" pool bevat alle sondes nummering 2, 4, 6, etc. en de "oneven" pool bevat sondes nummering 1, 3, 5, enz. verdunnen pool van de sondes op 100 uM concentratie en Bewaar bij -20 ° C. Alle experimenten worden uitgevoerd metbeide groepen, die als interne controle elkaar. Real RNA-afhankelijke signaal aanwezig zou zijn van beide zwembaden, terwijl de probe-specifieke geluiden zou uniek zijn voor elk zwembad. Dit geldt zowel voor Chirp-qPCR en Chirp-seq. 2. Harvest Cellen Verzamelen cellen die worden gebruikt voor Chirp experiment. Groei cellen in weefselkweek platen of kolven tot confluentie. Spoel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor eens en trypsinize. Quench trypsine met> 2x volume van de media, pipet op en neer naar de cellen los te maken en in enkele celsuspensie mengen. Breng alle media en geresuspendeerde cellen in 50 ml Falcon buizen. 20 miljoen cellen zijn gewoonlijk voldoende voor een Chirp monster. Spin cellen 800RCF 4 min. Zuig media en hersuspenderen 40 miljoen cellen in 40 ml PBS, combineren buizen indien nodig. Spin cellen 800RCF 4 min. Giet PBS, zorgvuldig te zuigen op een hoek de resterende vloeistof. </ol> 3. Cross-link Cellen en Collect celpellet Crosslink verzamelde cellen met glutaaraldehyde op RNA-chromatine interacties te bewaren en voor te bereiden celpellet. Voer alle stappen bij kamertemperatuur. Bereid 1% glutaaraldehyde bij kamertemperatuur PBS. Doe in 10 ml per 10 miljoen cellen (0,4 ml 25% glutaaraldehyde voorraad + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyde moet worden gebruikt fris. Tik onderkant van Falcon buizen aan pellets te verwijderen. Resuspendeer celpellet in 1% glutaaraldehyde, te beginnen met een klein volume te brokken te vermijden, dan herladen tot vol volume. Omkeren om te mengen. Crosslink 10 min. bij kamertemperatuur op een eind-tot-eind schudapparaat of rotator. Doof het verknopingsreactie met 1/10e volume van 1,25 M glycine bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Spin op 2000RCF gedurende 5 minuten. Zuig supernatant en was pellet met 20 ml koud PBS een keer, het spinnen op 2000RCF gedurende 5 minuten. Zuig en resuspendeer de wverast, cross-linked pellet met 1 ml gekoelde PBS per 20 miljoen cellen. Breng elke ml aan een Eppendorf buis en draaien op 2000RCF gedurende 3 minuten bij 4 C. Verwijder zoveel mogelijk met PBS pipetpunt nauwkeurig. De cel pellets in vloeibare stikstof en opslaan Flash-invriezen bij -80 ° C voor onbepaalde tijd. 4. Cell Lysis Lyseren verknoopt cellen cellysaat bereiden. Ontdooi bevroren celpellets bij kamertemperatuur. Tik op moeilijk te verjagen en meng de cel pellet. Draai beneden de pellet bij 2000RCF gedurende 3 minuten bij 4 ° C. Gebruik een scherpe 10 pl pipetpunt om de resterende PBS te verwijderen. Op een elektronische weegschaal (nauwkeurig tot op 1 mg) tarra de massa van een lege eppendorfbuisje (onze buizen wegen 1,060 gram zeer consequent). Weeg elke pellet en opnemen zijn gewicht. Een volledige 15 cm schotel van verknoopt HeLa cellen weegt meestal 100 mg. Supplement Lysis Buffer (10x de massa van de pellet, bijvoorbeeld 1 ml voor 100 mg) met FRESh Proteaseremmer, PMSF en Superase-in (zie bijgevoegde buffer lijst). Meng goed. Voeg 10X volume aangevuld Lysis Buffer aan elke buis en resuspendeer de pellet. Voor kleine pellets <25 mg, opnieuw in suspensie 250 ul aangevuld lysis buffer. schorsing moet glad zijn. zo niet, dan verdeelt de 500 pi porties en gebruik een gemotoriseerde pellet mixer te breken bosjes. ga onmiddellijk naar ultrasoonapparaat. 5. sonicatie shear dna door verknoopt cellysaten. bewerk met ultrasone trillingen cellysaat bioruptor 15 ml falcon buizen. <1,5 lysaat elke buis, snellere niet meer twee buizen per keer. 4 ° c waterbad hoogste stand van 30 seconden, 45 seconden off puls intervallen. controleer minuten. verder tot het troebel. dit kan slechts minuten liefst uur. aantalvan buizen, zal monster volume, bad temperatuur, periode ultrasoonapparaat tijd invloed hebben op hoe lang proces duurt. waarschijnlijk verschillende snelheden, dus bundelen ze samen om min herverdelen originele homogeniteit garanderen. let op: glutaaraldehyde-verknoopt cellen nemen aanzienlijk langer aan formaldehyde-equivalenten. bij duidelijk wordt, over dragen 5 nieuwe eppendorf buis. voeg 90 protease k (pk) buffer (zie lijst) pk. vortex mengen even spin down. incubeer 50 c. pak pcr qiagen zuivering kit. elueer elutiebuffer (eb) grootte 1% agarose gel. als grootste deel dna-uitstrijkje is 100-500 bp, voltooid. blijven trillingen. centrifugeer gesoniceerd monsters 16100rcf gedurende 10 combineer supernatanten, aliquot 1 flash-vries vloeibare nitrogen. bewaren -80 6. chirp hybridiseren gebiotinyleerde probes rna isoleren gebonden chromatine. ontdooien chromatine kamertemperatuur. bereid hybridisatiebuffer lijst buffers, voor bereiden 2 chromatine). mengen. typische lysaat, verwijder rna-input dna-input plaats houd ijs gebruik. breng totale volume ml, ontdooi sondes nanodrop bedragen controleren of u gebruikt lange (100 um moeten spec ~ 500-600 ng > toont de Chirp workflow. Een succesvolle Chirp experiment verrijkt typisch significant meer doel-RNA-specifieke RNAs. Figuur 2 verrijking van de menselijke telomerase RNA (TERC) van HeLa cellen over GAPDH een overvloed van cellulaire RNA dat als een negatieve controle. De meerderheid van TERC RNA's (~ 88%) in de cel aanwezig zijn naar beneden getrokken door het uitvoeren van tjilpen, terwijl slechts 0,46% van de GAPDH RNA werd teruggehaald, aantonen dat er een verrijking factor van ~ 200 maal. Aspecifieke probes zoals probes gericht LacZ RNA, die niet wordt uitgedrukt in zoogdiercellen (figuur 2) kan worden gebruikt als additionele negatieve controles. DNA-regio's verwacht dat de doelgroep lncRNA te binden zijn meestal verrijkt over negatieve regio's, gemeten door qPCR. Figuur 3 toont qPCR validatie van vier Hotair-gebonden sites in primaire humane voorhuid fibroblasten dat we bepaald door het uitvoeren van Chirp-seq in dezelfde cel lijn, terwijl TERC en GAPDH DNA websites seRVE als negatieve controle regio's. Zowel de "even" en "oneven" probe sets leverde vergelijkbare verrijking van de verwachte Hotair-gebonden sites over negatieve regio's, een kenmerk van echte lncRNA-bindende sites. High-throughput sequencing van Chirp verrijkte DNA levert een globale kaart van lncRNA-bindingsplaatsen. De Drosophila lncRNA roX2 bekend is de X-chromosoom interactie op een wijze die nodig is voor dosering vergoeding. Figuur 4 toont roX2 bindingsprofiel over een gedeelte van het X-chromosoom. Zowel de "even" en "oneven" monsters zijn gesequenced en hun unieke geluiden zijn geëlimineerd om een ​​track van overlappende signalen te produceren. Elke "piek" geeft hier een sterke site van roX2 bindend. De volledige baan en de lijst van roX2 genen zijn beschreven in Chu et al.. 2011 17. Figuur 1. Stroomdiagram van de Chirp proceduredure voorschrijft. Chromatine wordt verknoopt aan lncRNA: eiwitadducten in vivo Biotinylated tegelwerk probes gehybridiseerd aan lncRNA richten, en chromatine complexen worden gezuiverd met behulp van magnetische streptavidine kralen, gevolgd door strenge wasbeurten.. We elueren lncRNA gebonden DNA of eiwitten met een cocktail van RNase A en H. Een vermoedelijke lncRNA bindende sequentie wordt schematisch voorgesteld in de kleur oranje. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17 Figuur 2. Chirp verrijkt voor menselijke TERC RNA. TERC-asDNA sondes op te halen ~ 88% van de cellulaire TERC RNA en niet op te sporen GAPDH. LacZ-asDNA probes worden gebruikt als negatieve controles en ophalen niet RNAs. De gemiddelde + sd worden weergegeven. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17 Figuur 3. Hotair Chirp-qPCR in het primair mens voorEskin fibroblasten. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 en ABCA2 zijn regio's die samenwerken met Hotair. TERC en GAPDH dienden als negatieve controles. De gemiddelde + sd worden weergegeven. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17 Figuur 4. Chirp volgende gegevens roX2 RNA in Sl2 Drosophila cellen. "Even" en "oneven" werden afzonderlijk gesequenced, hun gegevens samen te voegen tot enige gemeenschappelijke pieken weerspiegelen in beide. De samengevoegde traject wordt weergegeven. Eerder verschenen in Chu et al.. 2011. 17

Discussion

Hier hebben we beschreven Chirp-seq, een methode in kaart brengen van in-vivo lncRNA bindingsplaatsen genoom-breed. De belangrijkste parameters voor succes zijn de splitsing poelen van tiling oligonucleotideprobes en glutaaraldehyde verknoping. Het ontwerp van affiniteit-probes is eenvoudig, gezien de RNA-sequentie en vereist geen voorkennis van de structuur van het RNA's of functionele domeinen. Ons succes met roX2, TERC en Hotair – drie in plaats van verschillende RNA's in twee soorten – suggereert dat Chirp-seq waarschijnlijk generaliseerbaar veel lncRNAs. Zoals met alle experimenten, zijn zorg en de juiste controles nodig zijn om de resultaten te interpreteren. Verschillende lncRNA kan titratie van omstandigheden en oordeelkundige verandering van omstandigheden, zoals selectie van verschillende affiniteit probes of verknopingsmiddelen vereisen, kunnen belichten verschillende aspecten van RNA-interacties chromatine. Net als ChIP-seq, niet alle bindende gebeurtenissen zijn noodzakelijkerwijs functioneel, en bijkomende studies nodig zijn om de biologische gevolgen van RNA-o vast te stellenccupancy op chromatine. Toch voorzien we vele interessante toepassingen van deze technologie voor onderzoekers van andere chromatine-geassocieerde lncRNAs, die nu in de duizenden ^8,9. Net zoals ChIP-seq heeft de deur geopend voor genoom-brede verkenningen van DNA-eiwit interacties, kan Chirp-seq studies van de "RNA interactoom" onthullen vele nieuwe mogelijkheden van de biologie.

Materials

Buffer List:

Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.

Lysis Buffer:

50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer (for DNA)

100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use

Hybridization Buffer

750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use

Wash Buffer

2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use

DNA elution Buffer

50 mM NaHCO3
1% SDS

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma Aldrich	G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer	VWR	V8185-904
Protease inhibitor	Roche	11873580001
PMSF	Sigma Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Falcon tubes (for sonication)	Corning	430790
Proteinase K	Ambion	AM2546
PCR purification kit	Qiagen	28106
C-1 magnetic beads	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma Aldrich	P7626-25G
DynaMag-15 magnet	Invitrogen	123-01D
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	123-21D
MIRNeasy mini kit	Qiagen	217004
Rnase H	Epicentre	R0601K
Rnase A	Sigma Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glycine	J.T. Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Elution Buffer (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
DNA-free	Ambion	AM1906
Buffer kit	Ambion	AM9010
Formamide	Invitrogen	15515-026