Isolement de la chromatine par purification d'ARN (CHIRP)

Summary

CHIRP est une nouvelle technique et rapide à la carte génomique des sites de liaison de l'ARN non codantes de longues (lncRNAs). La méthode tire parti de la spécificité des oligonucléotides carrelage anti-sens pour permettre le dénombrement des sites génomiques lncRNA assortis.

Abstract

ARN non codant longues sont des régulateurs clés de états de la chromatine pour des processus biologiques importants tels que la compensation de dosage, d'impression, et l'expression des gènes de développement ^{1,2,3,4,5,6,7.} La découverte récente de milliers de lncRNAs en association avec des complexes spécifiques modification de la chromatine, comme complexe Polycomb répressive 2 (PRC2) qui assure la médiation histone H3 lysine 27 triméthylation (H3K27me3), suggère grands rôles pour de nombreuses lncRNAs dans la gestion des états de chromatine dans un gène spécifique la mode ^8,9. Alors que certains sont lncRNAs pensé à travailler en cis sur les gènes voisins, d'autres travaillent dans lncRNAs trans pour réguler les gènes situés loin. Par exemple, chez la drosophile lncRNAs roX1 et roX2 régions lient de nombreux sur le chromosome X des cellules mâles, et sont essentiels pour ^10,11 compensation de dosage. Toutefois, les emplacements exacts de leurs sites de liaison ne sont pas connus à haute résolution. De même, l'homme lncRNA Hotair peut affecter PRC2 d'occupation sur les hes centaines de gènes du génome entier ^3,12,13, mais comment la spécificité est atteint n'est pas claire. LncRNAs peut également servir comme des échafaudages modulaires pour recruter l'assemblage des complexes protéiques multiples. Le classique agissant en trans ARN échafaud est le TERC ARN qui sert de modèle et d'échafaudage pour la télomérase complexe ^14; Hotair peut aussi servir comme un échafaudage pour PRC2 et une déméthylase H3K4 complexe ^13.

Des études antérieures de cartographie d'occupation ARN à la chromatine ont permis de mieux comprendre substantielles ^15,16, mais seulement à un seul locus à la fois. Les sites d'occupation de la plupart des lncRNAs ne sont pas connus, et les rôles de lncRNAs en matière de réglementation chromatine ont été la plupart du temps induite par les effets indirects de la perturbation lncRNA. Tout comme immunoprécipitation de la chromatine suivie par microarray ou séquençage en profondeur (ChIP-chip ou ChIP-seq, respectivement) a grandement amélioré notre compréhension des interactions protéine-ADN sur une échelle génomique, ici, nous illustrer un recenTLY publié stratégie pour cartographier l'occupation à long génome à ARN à l'échelle à haute résolution ^17. Cette méthode, d'isolement de la chromatine par purification d'ARN (CHIRP) (Figure 1), est basée sur la capture d'affinité de la cible lncRNA: complexe de la chromatine par carrelage antisens-oligos, qui génère alors une carte de la génomique des sites de liaison à une résolution de plusieurs centaines de bases avec de sensibilité et d'arrière-plan faible. CHIRP est applicable à de nombreux lncRNAs parce que la conception de sondes affinité est simple compte tenu de la séquence d'ARN et ne nécessite aucune connaissance de la structure de l'ARN ou des domaines fonctionnels.

Protocol

1. Conception de la sonde Conception d'ADN anti-sens de carrelage sondes pour la récupération sélective de l'ARN cible par Chirp. Sondes de conception oligo anti-sens en utilisant le concepteur de sonde en ligne à singlemoleculefish.com 18. Utilisez ces paramètres: nombre de sondes = 1 / sonde de 100 pb de longueur ARN; 2) Cible GC% = 45; longueur Espacement 4) = 60-80; 3) Longueur = 20 oligonucléotides. Pause d'ARN dans les segments s'il est trop long pour le concepteur. Omettre régions de répétitions ou d'homologie étendue. Sondes d'ADN de commande anti-sens avec BiotinTEG à 3-Premier fin. Des sondes marqueurs en fonction de leurs positions le long de l'ARN. Séparez-les en deux poules de sorte que le "même" pool contient toutes les sondes au nombre de 2, 4, 6, etc, et le «bizarre» pool contient des sondes au nombre de 1, 3, 5, etc Diluer pool de sondes à une concentration de 100 uM et conserver à -20 ° C. Toutes les expériences doivent être effectuées à l'aidedeux piscines, qui servent de contrôles internes pour l'autre. Réel ARN-dépendante du signal serait présent à partir de deux piscines, tandis que la sonde spécifiques bruits serait propre à chaque piscine. Ceci s'applique à la fois pour chirp-qPCR et CHIRP-seq. 2. Les cellules de récolte Recueillir les cellules qui seront utilisées pour l'expérience gazouiller. Cultiver les cellules dans des plaques de culture de tissus ou des flacons à la confluence. Rincer avec un tampon phosphate salin (PBS) et une fois trypsiniser. Quench trypsine avec un volume> 2x des médias, une pipette de haut en bas pour déloger les cellules et remettre en suspension seule cellule. Transférez tous les médias et les cellules remises en suspension dans 50 ml tubes Falcon. 20 millions de cellules sont généralement suffisante pour un échantillon gazouiller. Spin cellules à 800RCF pendant 4 min. Aspirer les médias et remettre 40 millions de cellules dans 40 ml de PBS, de combiner les tubes si nécessaire. Spin cellules à 800RCF pendant 4 min. Décanter PBS, aspirer délicatement sur un angle du liquide restant. </ol> 3. Croix-lier des cellules et collecte culot cellulaire Crosslink recueillies cellules avec du glutaraldéhyde à préserver l'ARN-chromatine interactions et de préparer culot cellulaire. Effectuez toutes les étapes à température ambiante. Préparer glutaraldéhyde à 1% à température ambiante PBS. Préparer 10 ml par 10 millions de cellules (0,4 ml de bouillon de glutaraldéhyde à 25% + 9,6 ml de PBS). Glutaraldéhyde doit être utilisée fraîche. Appuyez sur fond de tubes Falcon pour déloger pellets. Resuspendre culot cellulaire dans du glutaraldéhyde à 1%, en commençant par un petit volume pour éviter morceaux, puis compléter à plein volume. Mélanger par inversion. Crosslink pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur de bout en bout ou des rotateurs. Arrêter la réaction de réticulation avec le volume de 1/10e de 1,25 M de glycine à la température ambiante pendant 5 min. Centrifuger à 2000RCF pendant 5 min. Aspirer le surnageant et laver culot avec 20 ml refroidi PBS fois, tourne à 2000RCF pendant 5 min. Aspirer et remettre en suspension le wcendré, réticulé culot avec 1 ml de PBS par réfrigéré 20 millions de cellules. Transférer chaque ml dans un tube Eppendorf et centrifuger à 2000RCF pendant 3 min à 4 ° C. Retirez autant que possible avec du PBS pointe de la pipette avec soin. Flash geler les culots cellulaires dans l'azote liquide et stocker à -80 ° C indéfiniment. 4. Lyse cellulaire Lyser les cellules réticulées à préparer un lysat cellulaire. Décongeler les culots de cellules congelés à température ambiante. Tapez difficile à déloger et mélanger le culot cellulaire. Isoler le culot à 2000RCF pendant 3 min à 4 ° C. Utilisez une forte pointe de la pipette 10 ul de supprimer tout reste PBS. Sur une balance électronique (précision de 1 mg) la tare de la masse d'un tube vide Eppendorf (nos tubes pèsent 1.060 grammes très régulièrement). Peser chaque pastille et enregistrer son poids. Un plat complet de 15 cm de cellules HeLa réticulés pèse généralement 100 mg. Tampon de lyse Supplément (10X la masse de granulés de bois, par exemple 1 ml pour 100 mg) avec fresquesh Inhibiteur de la protéase, PMSF et Superase-in (voir la liste des tampons ci-jointe). Mélangez bien. Ajouter 10X tampon de lyse du volume complété à chaque tube et remettre le culot. Pour de petites boulettes <25 mg, remettre en suspension dans 250 ul de tampon lyse complétée. la doit être lisse. si ce n'est pas, il faut diviser 500 aliquotes et utiliser un véhicule motorisé à granulés mélangeur pour briser les mottes. procéder immédiatement une sonication. 5. sonication adn cisaillement par réticulés lysats cellulaires. soniquer lysat cellulaire bioruptor 15 ml tubes falcon. utilisation <1,5 chaque tube, accélérer sonication, pas plus deux fois. bain d'eau 4 ° c au réglage le élevé avec 30 secondes on, 45 off intervalles d'impulsions. vérifiez toutes min. continuer jusqu'à que traitement aux ultrasons est trouble. cela peut prendre aussi peu minutes heures. nombredes tubes, volume d'échantillon, température du bain, période temps se influer sur durée processus prend. sera probablement des taux différents, afin mettent commun min redistribuer d'origine assurer l'homogénéité. remarque: glutaraldéhyde réticulé cellules beaucoup leurs équivalents formaldéhyde. lorsque tourne clair, transférer 5 nouveau tube eppendorf. ajouter 90 d'adn protéase k (pk) (buffer voir liste) pk ul. vortex mélanger centrifuger brièvement. incuber pendant 50 c. extraire l'adn kit qiagen pcr purification. eluer d'élution (eb) vérifier taille gel d'agarose 1%. vrac frottis 100-500 pb, terminée. non, échantillons soniqués 16100rcf 10 combinez surnageants, 1 flash-gel nitroge liquiden. conserver -80 6. chirp hybrider sondes l'arn biotinylés d'isoler chromatine liée. décongeler complètement ambiante. préparer d'hybridation (voir liste tampons, 2 chromatine). mélanger. échantillon typique lysat, retirez input arn lieu gardez glace ultérieure. falcon tube. total ml, nanodrop montant vous ne l'avez utilisé long (100 um devraient spec ~ 500-600 ng > représente le flux de travail gazouiller. Une expérience réussie CHIRP enrichit généralement ARN cible de façon significative par rapport aux non-spécifiques des ARN. La figure 2 montre l'enrichissement de la télomérase humaine ARN (TERC) à partir de cellules HeLa sur GAPDH, un ARN cellulaire abondant qui sert de contrôle négatif. La majorité des ARN TERC (~ 88%) présents dans la cellule ont été tiré vers le bas en effectuant CHIRP, alors que seulement 0,46% de la GAPDH ARN a été récupéré, ce qui démontre un facteur d'enrichissement de ~ 200 fois. Sondes non spécifiques tels que des sondes ciblant l'ARN LacZ, qui n'est pas exprimé dans les cellules de mammifères (Figure 2), peut être utilisé comme d'autres témoins négatifs. Des régions d'ADN attendues pour lier le lncRNA cible sont généralement enrichies au cours régions négatifs lorsqu'elle est mesurée par qPCR. La figure 3 montre la validation qPCR de quatre Hotair assortis sites dans des fibroblastes primaires de prépuce humain que nous avons déterminé en effectuant CHIRP-seq dans la même lignée cellulaire, tandis que TERC et GAPDH l'ADN des sites soirve que les régions de contrôle négatif. Les deux «même» et «bizarre» la sonde fixe donné l'enrichissement comparable attendus Hotair assortis sites sur les régions négatives, une caractéristique des véritables lncRNA sites de liaison. Séquençage à haut débit de l'ADN enrichi CHIRP donne une carte mondiale des sites de liaison lncRNA. La drosophile lncRNA roX2 est connue pour interagir avec le chromosome X d'une manière qui est nécessaire pour la compensation de dosage. La figure 4 montre le profil de liaison roX2 sur une section du chromosome X. Les deux "même" et "impairs" échantillons ont été séquencés et leurs bruits uniques ont été éliminés pour produire une piste de signaux qui se chevauchent. Chaque «pic» indique ici un site fort de roX2 contraignant. La piste complète et la liste des roX2 gènes cibles ont été décrits dans Chu et al. 2011 17. Diagramme Figure 1. De la procédure CHIRPcédure. Chromatine est réticulée à lncRNA: adduits protéiques in vivo biotinylés sondes carrelage sont hybridées à cibler lncRNA et complexes chromatiniens sont purifiés en utilisant des billes de streptavidine magnétiques, suivie par des lavages strictes.. Nous éluer lncRNA ADN lié ou des protéines avec un cocktail de la RNase A et H. Une séquence lncRNA putatif de liaison est schématisée en orange. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17. Figure 2. Enrichit CHIRP pour l'homme TERC ARN. TERC-asDNA sondes de récupérer environ 88% de l'ARN cellulaire TERC et indétectable GAPDH. LacZ-asDNA sondes sont utilisés comme témoins négatifs et de récupérer ni ARN. Moyenne + sd sont présentés. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17. Figure 3. Hotair chirp-qPCR humaine primaire pourfibroblastes Eskin. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 et ABCA2 sont les régions qui interagissent avec Hotair. TERC et GAPDH ont servi de témoins négatifs. Moyenne + sd sont présentés. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17. Figure 4. CHIRP-seq de données de roX2 ARN dans les cellules de drosophile SL2. "Même" et "bizarre" ont été séquencés séparément; leurs données fusionnent pour ne tenir compte que des pics communs à la fois. La piste fusionnée est montré. Précédemment publié dans Chu et al. 2011 17.

Discussion

Ici, nous avons décrit CHIRP-seq, une méthode de cartographie des sites de liaison in vivo lncRNA l'échelle du génome. Les paramètres clés de la réussite sont les piscines fendues de carrelage sondes oligonucléotidiques et de réticulation au glutaraldéhyde. La conception de sondes affinité est simple compte tenu de la séquence d'ARN et ne nécessite aucune connaissance préalable de la structure de l'ARN ou des domaines fonctionnels. Notre succès avec roX2, TERC, et Hotair – trois ARN assez différentes dans les deux espèces – suggère que CHIRP-seq est probable généralisables à de nombreux lncRNAs. Comme avec toutes les expériences, les contrôles de soins et de bonne sont tenus d'interpréter les résultats. LncRNA différents peuvent nécessiter des conditions de titrage, et les changements judicieux de conditions, telles que la sélection de sondes d'affinité différentes ou des agents de réticulation, peut mettre en évidence différents aspects de l'ARN-chromatine interactions. Comme ChIP-seq, tous les événements de liaison ne sont pas nécessairement fonctionnelle, et des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les conséquences biologiques de l'ARN occupancy sur la chromatine. Néanmoins, nous prévoyons de nombreuses applications intéressantes de cette technologie pour les chercheurs d'autres chromatine associés lncRNAs, qui sont actuellement au nombre des milliers ^8,9. Tout comme ChIP-seq a ouvert la porte à l'échelle du génome des explorations de interactions ADN-protéines, chirp-études suivants de la "interactome ARN" peut révéler beaucoup de nouvelles avenues de la biologie.

Materials

Buffer List:

Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.

Lysis Buffer:

50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer (for DNA)

100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use

Hybridization Buffer

750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use

Wash Buffer

2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use

DNA elution Buffer

50 mM NaHCO3
1% SDS

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma Aldrich	G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer	VWR	V8185-904
Protease inhibitor	Roche	11873580001
PMSF	Sigma Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Falcon tubes (for sonication)	Corning	430790
Proteinase K	Ambion	AM2546
PCR purification kit	Qiagen	28106
C-1 magnetic beads	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma Aldrich	P7626-25G
DynaMag-15 magnet	Invitrogen	123-01D
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	123-21D
MIRNeasy mini kit	Qiagen	217004
Rnase H	Epicentre	R0601K
Rnase A	Sigma Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glycine	J.T. Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Elution Buffer (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
DNA-free	Ambion	AM1906
Buffer kit	Ambion	AM9010
Formamide	Invitrogen	15515-026