בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Summary

ציוץ הוא טכניקה חדשנית ומהירה למפות אתרי הקישור הגנומי של RNAs noncoding ארוכות (lncRNAs). השיטה מנצלת את הייחודיות של תחושת אנטי oligonucleotides ריצוף כדי לאפשר ספירה של lncRNA הנכנס אתרים הגנומי.

Abstract

RNAs noncoding ארוכים הם וסתים מרכזיים של הכרומטין מדינות תהליכים ביולוגיים חשובים כגון פיצוי המינון, החתמה, ועל ביטוי גנים התפתחותיים ^{1,2,3,4,5,6,7.} התגלית האחרונה של אלפי lncRNAs בשיתוף עם ספציפיים שינוי מתחמי הכרומטין, כגון קומפלקס מדכא Polycomb 2 (PRC2) כי מתווך היסטון H3 ליזין 27 trimethylation (H3K27me3), מציע תפקידים רחבים עבור lncRNAs רבים בניהול מדינות הכרומטין של הגן הספציפי אופנה ^8,9. בעוד כמה lncRNAs נחשבים לעבוד בחבר העמים על גנים סמוכים, lncRNAs אחרים לעבוד טרנס להסדיר גנים הממוקמים רחוק. למשל, תסיסנית lncRNAs roX1 ו roX2 לאגד באזורים רבים על כרומוזום X של תאים זכריים, הם קריטיים עבור פיצוי במינון ^10,11. עם זאת, המיקומים המדויקים של אתרי הקישור שלהם אינם ידועים ברזולוציה גבוהה. באופן דומה, אדם lncRNA HOTAIR יכול להשפיע PRC2 תפוסה על Hundreds של גנים בגנום כולו ^3,12,13, אבל איך הספציפיות מושגת אינו ברור. LncRNAs יכול גם לשמש פיגומים מודולריים לגייס את הרכבה של קומפלקסים חלבונים רבים. קלאסי חוצה משחק RNA הפיגום הוא RNA TERC המשמש תבנית ואת הפיגום על telomerase מורכב ^14; HOTAIR יכול גם לשמש פיגום עבור PRC2 ו demethylase H3K4 מורכב ^13.

מחקרים קודמים מיפוי תפוסה RNA על הכרומטין חשפו תובנות משמעותיות ^15,16, אבל רק לוקוס גן יחיד בכל פעם. האתרים התפוסה של רוב lncRNAs אינם ידועים, וכן את התפקידים של lncRNAs בוויסות הכרומטין היה להסיק בעיקר את ההשפעות העקיפות של ההפרעות lncRNA. כשם immunoprecipitation הכרומטין ואחריו microarray או רצף עמוק (שבב שבב או שבב seq, בהתאמה) השתפר מאוד את הבנתנו-DNA חלבון אינטראקציות בקנה מידה גנומי, הנה אנחנו להמחיש recenפורסם tly האסטרטגיה למפות רב תפוסה RNA הגנום כולו ברזולוציה גבוהה ^17. , שיטה זו בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ) (איור 1), מבוסס על לכידת הזיקה של יעד lncRNA: מורכב הכרומטין על ידי ריצוף antisense-oligos, אשר לאחר מכן יוצרת מפה של אתרי הקישור הגנומי ברזולוציה של מאות בסיסים שונים עם רגישות גבוה ונמוך רקע. ציוץ הוא ישים lncRNAs רבים בגלל העיצוב של זיקה הבדיקות, הוא פשוט נתן את רצף הרנ"א ואינה דורשת ידע על מבנה של RNA או תחומים פונקציונליים.

Protocol

1. החללית עיצוב נגד חוש עיצוב ריצוף ה-DNA בדיקות לאחזור סלקטיבית של RNA המטרה על ידי ציוץ. נגד חוש עיצוב oligo בדיקות באמצעות מעצב בדיקה באינטרנט singlemoleculefish.com 18. השתמש פרמטרים: מספר בדיקות = 1 בדיקה / 100 נ"ב באורך RNA; 2) יעד GC% = 45, 3) אורך oligonucleotide = 20, 4) אורך מרווח = 60-80. לשבור RNA למקטעים אם יותר מדי זמן עבור מעצב. השמט אזורי חוזר או הומולוגיה נרחבת. נגד תחושת סדר בדיקות דנ"א עם BiotinTEG בסוף 3-הממשלה. תווית בדיקות על פי עמדותיהם לאורך RNA. להפריד אותם לשתי בריכות, כך הבריכה ", גם" מכיל את כל בדיקות מספור 2, 4, 6, וכו 'בריכת "מוזר" כולל בדיקות המונים 1, 3, 5 וכו' מדולל מאגר של בדיקות לריכוז 100 מיקרומטר ו החנות ב -20 ° C. כל הניסויים שיבוצעו באמצעותשתי בריכות, המהווים הבקרות הפנימיות זה לזה. אות אמיתי RNA תלוי יהיה נוכח מבריכות הצדדים, תוך בדיקה ספציפיים רעשים יהיה ייחודי כל מאגר. זה חל גם על ציוץ ו-QPCR ציוץ-seq. 2. קציר תאים איסוף תאים שישמשו לניסוי ציוץ. לגדל תאים בתרבית רקמה צלחות או צלוחיות ל confluency. יש לשטוף עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) פעם אחת trypsinize. להרוות טריפסין עם נפח> 2x של התקשורת, פיפטה למעלה ולמטה כדי לסלק תאים resuspend אל ההשעיה תא בודד. להעביר את כל המדיה ותאי resuspended לתוך צינורות 50 מ"ל פלקון. 20 מיליון תאים הם בדרך כלל די מדגם ציוץ אחד. ספין תאים ב 800RCF דקות 4. התקשורת aspirate ו resuspend 40 מיליון תאים של 40 מ"ל של PBS, לשלב צינורות במידת הצורך. ספין תאים ב 800RCF דקות 4. למזוג PBS, לשאוב היטב על זווית את הנוזל הנותר. </ol> 3. חוצה קישור תאים איסוף Cell גלולה Crosslink אספו תאים עם glutaraldehyde לשמר RNA-הכרומטין אינטראקציות ולהכין תא גלולה. לבצע את כל הפעולות בטמפרטורת החדר. הכן glutaraldehyde 1% בטמפרטורת החדר PBS. הכן 10 מ"ל לכל 10 מיליון תאים (0.4 מ"ל glutaraldehyde המניה 25% + 9.6 מ"ל PBS). Glutaraldehyde יש להשתמש טרי. לחץ התחתון של צינורות פלקון כדי לסלק כדורי. Resuspend תא גלולה ב glutaraldehyde 1%, החל בנפח קטן, כדי למנוע גושים, ואחר כך למעלה עד נפח מלא. הפוך לערבב. Crosslink עבור 10min בטמפרטורת החדר על הקצה לקצה שייקר או הכתף. להרוות את התגובה cross-linking עם נפח 1/10th של 1.25 מ 'גליצין בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מסובבים 2000RCF דקות 5. Aspirate supernatant ולהתרחץ גלולה עם 20 מ"ל צינן PBS פעם אחת, מסתובב ב 2000RCF במשך 5 דקות. Aspirate ו resuspend Washed, צולבים גלולה עם 1 מ"ל PBS צונן לכל 20 מיליון תאים. להעביר את כל מ"ל למבחנה Eppendorf ו ספין על 2000RCF דקות 3 ב 4 ג הסר PBS ככל האפשר עם קצה פיפטה בזהירות. Flash-להקפיא את כדורי סלולריים בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C ללא הגבלת זמן. 4. תא תמוגה Lyse תאים crosslinked להכין lysate התא. להפשיר כדורי סלולריים קפואים בטמפרטורת החדר. הקש קשה לעקור ומערבבים תא גלולה. ספין למטה גלולה ב 2000RCF דקות 3 ב 4 ° C. השתמש קצה חד פיפטה 10 μl להסיר כל PBS הנותרים. על יתרת אלקטרוני (ומדויק במינון של 1) טרה המונית של צינור Eppendorf ריק (צינורות שלנו שוקל 1.060 גרם מאוד עקבי). לשקול כל גלולה ולהקליט את משקלו. צלחת מלאה 15 ס"מ של תאים הלה crosslinked בדרך כלל שוקל 100 מ"ג. תמוגה מאגר מוסף (10X המוני של גלולה, 1 מ"ל למשל עבור 100 מ"ג) עם fresH פרוטאז מעכב, PMSF ו Superase-in (ראו רשימה חיץ המצורפת). מערבבים היטב. הוספת נפח 10X בתוספת מאגר תמוגה לצינור כל resuspend גלולה. עבור כדוריות קטנות <25 מ"ג, resuspend במאגר תמוגה μl 250 בתוספת. ההשעיה צריכה להיות חלקה. אם לא, לחלק את תוך 500 aliquots ולהשתמש גלולה ממונע מערבל להיפרד גושים. לפנות מיד sonication. 5. sonication ה-dna על ידי גזירה sonicating lysates סלולריים crosslinked. sonicate lysate תא bioruptor ב -15 צינורות מ"ל פלקון. השתמש <1.5 בצינור אחד, ועל מהר יותר, לא יותר מ 2 בכל פעם. אמבטיה 4 c ° המים ההגדרה הגבוהה ביותר עם 30 שניות על, 45 מרווחי הדופק. בדוק כל דקות. המשך עד התא לעכור עוד. זה עלול לקחת קצת כמו דק 'ו רבים שעות. מספרשל צינורות, נפח דגימה, טמפרטורת אמבטיה, פרק הזמן ישפיע כמה זמן טיפול כזה נמשך. סביר להניח בקצב שונה, כך בריכה אותם יחד דקות להפיץ מחדש אל המקוריים מנת להבטיח אחידות. הערה: glutaraldehyde-crosslinked תאים רב באופן משמעותי מאשר ושווי פורמלדהיד. כאשר הופכת ברורה, להעביר 5 לצינור eppendorf טרי. הוסף 90 פרוטאז k (pk) מאגר (ראה רשימת חיץ) ו קי μl. מערבולת לערבב ומסובב בקצרה. דגירה של 'ב 50 c. תמצית ערכת טיהור pcr qiagen. elute qiagen elution (eb) וסמנו גודל 1% agarose ג'ל. עיקר למרוח הוא 100-500 bp, הושלמה. ממשיכים sonicate. סרכזת דגימות sonicated 16100rcf במשך 10 שלב supernatants, aliquot 1 דוגמאות ו-flash הקפאת nitroge נוזליn. חנות -80 6. ציוץ להכליא בדיקות דנ"א biotinylated ל rna ולבודד הכרומטין מאוגד. ההפשרה בטמפרטורת החדר. הכינו הכלאה חיץ, להכין לכל הכרומטין). לערבב. למדגם טיפוסי באמצעות lysate, להסיר עבור קלט dna ומניחים eppendorf. שמור הקרח לשימוש נוסף. מעבירים למבחנה 15 אחד. הנפח הכולל מ"ל, להפשיר nanodrop כדי לבדוק כמות השתמשו בו (100 מיקרומטר צריך spec ~ 500-600 ng > מתאר את זרימת העבודה ציוץ. הניסוי המוצלח בדרך כלל ציוץ מעשיר RNA היעד באופן משמעותי על שאינם ספציפיים RNAs. תרשים 2 מציג העשרת telomerase RNA אנושי (TERC) מתאי הלה על GAPDH,-RNA סלולריים בשפע המשמשת בקרת שלילית. רוב RNAs TERC (~ 88%) הנמצאים בתא נשלפו על ידי ביצוע ציוץ, ואילו רק 0.46% מכלל GAPDH RNA אוחזר, הוכחת גורם העשרה של פי 200 ~. בדיקות ספציפי כגון בדיקות מיקוד LacZ RNA, אשר לא באה לידי ביטוי בתאי יונקים (איור 2), יכול לשמש בקרות שליליות נוספות. אזורי דנ"א צפויות לאגד lncRNA היעד מועשרים בדרך כלל על פני אזורים שליליות כאשר נמדד על ידי QPCR. איור 3 מציג אימות QPCR ארבעה HOTAIR הנכנס האתרים העיקריים fibroblasts העורלה האדם שקבענו על ידי ביצוע ציוץ-SEQ בתור אותו התא, בעוד TERC ו GAPDH DNA אתרים SErve כאזורים שליטה שליליות. גם "אפילו" ו החללית "מוזר" קובע העשרה דומה הניב של HOTAIR הנכנס אתרים הצפויים על פני אזורים שליליים, סימן ההיכר של lncRNA מחייבים אתרי אמיתיים. תפוקה גבוהה של רצף ה-DNA ציוץ מועשר מניב המפה העולמית של lncRNA מחייבים אתרים. LncRNA תסיסנית roX2 ידועה אינטראקציה עם כרומוזום ה-X באופן נדרש פיצוי המינון. איור 4 מראה roX2 פרופיל מחייב על קטע של כרומוזום X. שניהם "ואפילו" ואת "מוזר" דגימות כבר רצף ורעשים הייחודיים שלהם נמחקו לייצר מסלול של אותות חופפים. כל "הפסגה" כאן מציין אתר חזק של roX2 מחייב. מסלול מלא רשימת roX2 גני מטרה תוארו צ et al. 2011 17. 1. תרשים זרימה תרשים של proce ציוץדורה. הכרומטין הוא crosslinked כדי lncRNA: adducts חלבון in vivo בדיקות ריצוף Biotinylated הם הכלאה למקד lncRNA, ואת מתחמי הכרומטין הם מטוהרים באמצעות חרוזים streptavidin מגנטיים, ואחריו שוטף מחמירים.. אנחנו elute DNA lncRNA כבול או חלבונים עם קוקטייל של Rnase וה 'רצף המשוערת lncRNA מחייב הוא schematized בכתום. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17 2. איור ציוץ מעשירה עבור האדם TERC RNA. TERC-asDNA בדיקות לאחזר ~ 88% הסלולר TERC רנ"א GAPDH לגילוי. LacZ-asDNA בדיקות משמשים בקרות שליליות ולאחזר לא על RNAs. ממוצע + SD מוצגים. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17 איור 3. HOTAIR ציוץ-QPCR ב האדם העיקריfibroblasts אסקין. NFKBIA, HOXD3-4, SERINC5 ו ABCA2 הם אזורים כי אינטראקציה עם HOTAIR. TERC ו GAPDH שימש בקרות שליליות. ממוצע + SD מוצגים. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17 איור 4. ציוץ-SEQ נתונים של roX2 RNA בתאים Sl2 תסיסנית. "אפילו" ו "מוזר" היו רצף בנפרד; הנתונים שלהם משקפים רק במיזוג פסגות הנפוצות הן. המסלול מוצג הממוזג. פורסם בעבר צ'ו et al. 2011. 17

Discussion

כאן תיארנו ציוץ-seq, שיטת מיפוי באתרים ב vivo lncRNA מחייב הגנום כולו. הפרמטרים העיקריים להצלחה הם בריכות מפוצלים של ריצוף בדיקות oligonucleotide ו crosslinking glutaraldehyde. העיצוב של זיקה הבדיקות, הוא פשוט נתן את רצף הרנ"א ואינה דורשת ידע מוקדם על מבנה של RNA או תחומים פונקציונליים. ההצלחה שלנו עם roX2, TERC, ו HOTAIR – שלושה RNAs שונות למדי בשני המינים – מצביע על כך ציוץ-seq היא להכליל צפוי lncRNAs רבים. כמו עם כל הניסויים, פקדי טיפול ונכון נדרשים לפרש את התוצאות. LncRNA שונים עשויים לדרוש טיטרציה של התנאים, ושינוי מושכל של תנאים, כגון מבחר של בדיקות קרבה או crosslinkers שונים, עשוי להדגיש היבטים שונים של RNA-הכרומטין אינטראקציות. כמו SEQ-Chip, לא כל האירועים המחייבים הינם פונקציונלי בהכרח, ועל מחקרים נוספים נדרשים כדי לברר את ההשלכות הביולוגיות של RNA Occupancy על הכרומטין. עם זאת, אנו צופים יישומים מעניינים של טכנולוגיה זו עבור חוקרים של הכרומטין הקשורים lncRNAs אחרים, אשר כעת מספר אלפי ^8,9. בדיוק כמו שבב ואילך פתחה את הדלת הגנום כולו החקירות של אינטראקציות חלבון דנ"א, ציוץ-seq מחקרים של "RNA interactome" עשוי לחשוף אפיקים חדשים רבים של הביולוגיה.

Materials

Buffer List:

Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.

Lysis Buffer:

50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer (for DNA)

100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use

Hybridization Buffer

750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use

Wash Buffer

2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use

DNA elution Buffer

50 mM NaHCO3
1% SDS

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma Aldrich	G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer	VWR	V8185-904
Protease inhibitor	Roche	11873580001
PMSF	Sigma Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Falcon tubes (for sonication)	Corning	430790
Proteinase K	Ambion	AM2546
PCR purification kit	Qiagen	28106
C-1 magnetic beads	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma Aldrich	P7626-25G
DynaMag-15 magnet	Invitrogen	123-01D
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	123-21D
MIRNeasy mini kit	Qiagen	217004
Rnase H	Epicentre	R0601K
Rnase A	Sigma Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glycine	J.T. Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Elution Buffer (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
DNA-free	Ambion	AM1906
Buffer kit	Ambion	AM9010
Formamide	Invitrogen	15515-026