Chromatin Isolering af RNA Oprensning (chirp)

Summary

Chirp er en hidtil ukendt og hurtig teknik til at kortlægge genomiske bindingssteder lange kodende RNA'er (lncRNAs). Metoden benytter sig af de særlige anti-sense-tagsten oligonukleotider at tillade optælling af lncRNA-bundne genomiske sites.

Abstract

Lange noncoding RNA er vigtige regulatorer af kromatin stater for vigtige biologiske processer såsom dosering kompensation, prægning, og udviklingsmæssige genekspression ^{1,2,3,4,5,6,7.} Den nylige opdagelse af tusindvis af lncRNAs i samarbejde med specifikke kromatin ændring komplekser, såsom Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2), der medierer histon H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3), foreslår roller, for mange lncRNAs i forvaltningen af ​​kromatin stater i et gen-specifik mode ^8,9. Mens nogle lncRNAs menes at virke i cis for tilstødende gener, andre lncRNAs arbejder i trans for at regulere fjernt beliggende gener. For eksempel er Drosophila lncRNAs roX1 og roX2 binder mange regioner på X-kromosomet af mandlige celler og kritisk for dosering erstatning ^10,11. Imidlertid er de nøjagtige placeringer af deres bindingssteder ikke kendt med høj opløsning. Tilsvarende kan humant lncRNA HOTAIR påvirke PRC2 belægning på hundreds af gener genom-dækkende ^3,12,13, men hvordan specificitet opnås, er uklart. LncRNAs kan også tjene som modulære stilladser at rekruttere samling af flere protein komplekser. Den klassiske trans-virkende RNA stillads er tert RNA, der tjener som template og stativ til telomerase komplekset ^14, HOTAIR kan også tjene som et stillads til PRC2 og H3K4 demethylase kompleks ^13.

Tidligere undersøgelser kortlægning RNA belægning på chromatin har afsløret væsentlige indsigt ^15,16, men kun ved en enkelt genlocus ad gangen. De belægning steder fleste lncRNAs er ikke kendt, og de roller lncRNAs i kromatin forordning er blevet det meste udledes de indirekte effekter af lncRNA forstyrrelse. Ligesom kromatin immunofældning efterfulgt af microarray eller dyb sekventering (Chip-chip eller chip-seq, henholdsvis) har i høj grad forbedret vores forståelse af protein-DNA interaktioner på en genomisk skala, her viser vi en recently offentliggjort strategi for at kortlægge lange RNA belægning genom-dækkende i høj opløsning ^17. Denne fremgangsmåde, chromatin Isolation af RNA Oprensning (chirp) (figur 1), er baseret på affiniteten indfangning af mål lncRNA: chromatin kompleks af fliser antisense-oligoer, der genererer derefter et kort over genomiske bindingssteder med en opløsning af flere hundrede baser med høj følsomhed og lav baggrund. Chirp er anvendelig til mange lncRNAs fordi udformningen af ​​affinitets-prober er ligetil givet RNA-sekvens og kræver ingen viden om RNA struktur eller funktionelle domæner.

Protocol

1. Sondedesign Design anti-sense DNA fliseopsætning prober til selektiv udtagning af RNA-målet af chirp. Design anti-sense-oligo-sonder ved hjælp af online-sonden designer hos singlemoleculefish.com 18. Anvendes følgende parametre: antal prober = en probe / 100 bp af RNA længde, 2) Target GC% = 45, 3) oligonucleotid længde = 20, 4) afstand længde = 60-80. Break RNA ind i segmenter, hvis for længe for designeren. Udelade regioner gentagelser eller omfattende homologi. Ordens anti-sense DNA-prober med BiotinTEG ved 3-prime enden. Mærkeprober efter deres positioner langs RNA. Adskille dem i to puljer, således at "selv" pool indeholder alle prober nummerering 2, 4, 6, osv., og den "ulige" pulje indeholder prober nummerering 1, 3, 5 osv. fortyndes pulje af prober til 100 uM koncentration og Opbevar ved -20 ° C. Alle eksperimenter skal udføres ved hjælpbegge puljer, der tjener som interne kontroller for hinanden. Fast RNA-afhængige signal ville være til stede fra begge puljer, mens probe-specifikke støj vil være unikt for hver pulje. Dette gælder for både Chirp-qPCR og Chirp-ff. 2. Harvest Celler Indsamle cellerne, der skal anvendes til chirp eksperiment. Dyrke celler i vævskulturplader eller-kolber til konfluens. Skylning med phosphatbufret saltvand (PBS) gang Trypsinisér. Dæmpning trypsin med> 2x volumen medier pipette op og ned for at fjerne celler og resuspenderes i en enkelt cellesuspension. Overfør alle medier og resuspenderede celler i 50 ml Falcon rør. 20 millioner celler er typisk tilstrækkelig til en chirp prøve. Spinde cellerne ved 800RCF i 4 minutter. Aspirer medier og resuspender 40 millioner celler i 40 ml PBS, kombinere rør om nødvendigt. Spinde cellerne ved 800RCF i 4 minutter. Dekanteres PBS forsigtigt aspireres i en vinkel den resterende væske. </ol> 3. Cross-link celler og indsamle cellebundfaldet Tværbinding opsamlet celler med glutaraldehyd for at bevare RNA-chromatin interaktioner og forberede cellepellet. Udfør alle trin ved stuetemperatur. Forbered 1% glutaraldehyd i stuetemperatur PBS. Fremstilling af 10 ml pr 10 millioner celler (0,4 ml 25% glutaraldehyd lager + 9,6 ml PBS). Glutaraldehyd skal anvendes frisk. Tryk bunden af ​​Falcon-rør til at løsne pellets. Resuspender cellepelleten i 1% glutaraldehyd, startende med et lille volumen for at undgå klumper, og derefter supplere op til fuld volumen. Invert at blande. Tværbinding af 10 min ved stuetemperatur på en ende-til-ende rysteapparat eller rotator. Standse tværbindingsreaktionen med 1/10th volumen 1,25 M glycin ved stuetemperatur i 5 min. Rotere med 2000RCF i 5 min. Aspirer supernatanten og vask pelleten med 20 ml afkølet PBS gang centrifugering ved 2000RCF i 5 min. Aspirer og resuspender wforaskede, tværbundet pellet med 1 ml afkølet PBS pr 20 millioner celler. Overfør hver ml til et Eppendorf-rør og centrifugering ved 2000RCF i 3 minutter ved 4 ° C. Fjern så meget PBS som muligt med pipettespidsen omhyggeligt. Lynfryser cellepellets i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C på ubestemt tid. 4. Cellelyse Lyse tværbundne celler til fremstilling af cellelysatet. Optø frosne cellepellets ved stuetemperatur. Tryk vanskeligt at fjerne og blande cellepelleten. Vågeblus pelleten ved 2000RCF i 3 minutter ved 4 ° C. Anvende en skarp 10 ul pipettespidsen at fjerne eventuel resterende PBS. På en elektronisk vægt (nøjagtighed på 1 mg) tara massen af ​​et tomt Eppendorf rør (vores rør vejer 1.060 gram meget konsekvent). Vejes hver pellet og registrere sin vægt. En fuld 15 cm skål af krydsbundne HeLa celler typisk vejer 100 mg. Supplement lyseringsbuffer (10X massen af ​​pelleten, fx 1 ml til 100 mg) med Fresh proteasehæmmer, PMSF og Superase-in (se vedlagte buffer liste). Bland godt. Tilsættes 10X volumen suppleret lyseringsbuffer til hvert rør og resuspender pelleten. For små pellets <25 mg, resuspenderes i 250 pi suppleret lysisbuffer. suspension skal være glat. hvis ikke, opdele 500 alikvoter og anvende en motoriseret pellet mixer til at bryde op klumper. fortsæt straks lydbehandling. 5. sonikering forskydning dna ved tværbundne cellelysater. sonikeres cellelysat bioruptor 15 ml falcon-rør. <1,5 lysat hvert rør, for hurtigere sonikering, ikke mere end to rør ad gangen. et 4 ° c vandbad højeste indstilling med 30 sekunder på, 45 fra impulsintervaller. se hver min. fortsætter indtil cellelysatet længere uklar. dette kan tage så lidt som minutter mange timer. antalletaf vil det prøvevolumen, badtemperaturen, perioden af ​​lydbehandling tid påvirker hvor lang tager. sandsynligvis forskellige hastigheder, samle dem sammen min videredistribuere ind originale sikre homogenitet. bemærk: glutaraldehyd-tværbundet celler tager betydeligt formaldehyd ækvivalenter. når lysatet bliver klar, overføres 5 frisk eppendorf-rør. tilsættes 90 ul protease k (pk) puffer (se liste) pk. vortex blande spin ned kortvarigt. inkuber 50 c. ekstrahere qiagen pcr purification kit. eluatet elueringsbuffer (eb) kontrol størrelse på 1% agarosegel. størstedelen ​​dna'et smear er 100-500 bp, fuldstændig. sonikeres. centrifugeres sonikerede prøver 16100rcf 10 kombiner supernatanter alikvote 1 flash-frost flydende nitrogen. opbevares -80 6. chirp hybridisering biotinylerede dna-prober rna isolere bundet kromatin. tø kromatin stuetemperatur. forberede hybridiseringsbuffer listen fremstilling 2 per kromatin). blande. typisk prøve anvendelse lysatet, fjernes input anbringes hold is videre brug. overføre chromatin rør. samlede volumen ml, du bruge eppendorfrør. prober nanodrop sonder kontrollere beløbet, har brugt (100 um bør spec ~ 500-600 ng > viser Chirp arbejdsgang. En vellykket Chirp eksperiment typisk beriger mål-RNA betydeligt i forhold til ikke-specifikke RNA'er. Figur 2 viser berigelsen af human telomerase RNA (tert) fra HeLa-celler end GAPDH, en rigelig cellulært RNA, der tjener som en negativ kontrol. Størstedelen af ​​tert RNA'er (~ 88%) til stede i cellen, blev trukket ned ved at udføre chirp, hvorimod kun 0,46% af GAPDH-RNA blev udtaget, viser en berigelsesfaktor på ~ 200 fold. Uspecifikke prober såsom prober rettet LacZ-RNA, som ikke udtrykkes i mammale celler (figur 2), kan anvendes som yderligere negative kontroller. DNA-regioner forventes at binde målet lncRNA typisk beriget med negative regioner, når målt ved qPCR. Figur 3 viser qPCR validering af fire HOTAIR-bundne steder i primære humane forhudsfibroblaster, at vi bestemt ved at udføre Chirp-seq i den samme cellelinje, mens tert og GAPDH DNA sites selvRVE som negativ kontrol regioner. Både "selv" og "ulige" sonde sætter gav sammenlignelige berigelse af forventede HOTAIR-bundne steder end negative regioner, et adelsmærke for ægte lncRNA-bindingssteder. High-throughput sekventering af Chirp beriget DNA giver et globalt kort over lncRNA-bindingssteder. Drosophila lncRNA roX2 vides at interagere med X-kromosomet på en måde, der er nødvendig for dosering erstatning. Figur 4 viser roX2 binding profil over en del af X-kromosomet. Både "selv" og "mærkelige" prøver er blevet sekventeret og deres unikke lyde er blevet fjernet for at frembringe et spor af overlappende signaler. Hver "peak" her viser en kraftig sted roX2 binding. Den komplette spor og over roX2 målgener er blevet beskrevet i Chu et al. 2011 17. Figur 1. Rutediagram af chirp procedure. Chromatin tværbindes til lncRNA: proteinaddukter in vivo Biotinylerede flisebelægning prober hybridiseret til målsekvensen lncRNA og chromatin komplekser oprenses under anvendelse af magnetiske streptavidin-perler, efterfulgt af strenge vaske.. Vi eluerede lncRNA bundne DNA eller proteiner med en cocktail af RNase A og H. En formodet lncRNA bindingssekvens er skematiseret i orange. Tidligere offentliggjort i Chu et al. 2011. 17 Figur 2. Chirp beriger for menneskers tert-RNA. Tert-asDNA prober hente ~ 88% af cellulær tert RNA og upåviselig GAPDH. LacZ-asDNA prober anvendes som negative kontroller og hente hverken RNA'er. Gennemsnit ± SD er vist. Tidligere offentliggjort i Chu et al. 2011. 17 Figur 3. HOTAIR chirp-qPCR i primær human tilEskin fibroblaster. NFKBIA, HOXD3-4 SERINC5 og ABCA2 er områder, der interagerer med HOTAIR. tert og GAPDH tjente som negative kontroller. Gennemsnit ± SD er vist. Tidligere offentliggjort i Chu et al. 2011. 17 Figur 4. Chirp-seq data for roX2 RNA i SL2 Drosophila-celler. "Selv" og "ulige" blev sekventeret separat, deres data fusionere kun afspejler fælles toppe i både. Den fusionerede spor vises. Tidligere offentliggjort i Chu et al. 2011. 17

Discussion

Her beskrev Chirp-ff, en metode til kortlægning in vivo lncRNA bindingssteder genom-dækkende. De vigtigste parametre for succes er delte puljer af fliser oligonukleotidproberne og glutaraldehyd tværbindings. Udformningen af ​​affinitets-prober er ligetil givet RNA-sekvens og ikke kræver forudgående kendskab til RNA struktur eller funktionelle domæner. Vores succes med roX2, tert, og HOTAIR – tre ret forskellige RNA i to arter – tyder på, at Chirp-seq sandsynligvis generaliseres til mange lncRNAs. Som med alle eksperimenter, der er pleje og korrekt kontrol forpligtet til at fortolke resultaterne. Forskellige lncRNA kan kræve titrering af betingelser, og velovervejet ændring af betingelser, såsom udvælgelse af forskellige affinitets-prober eller tværbindere, kan fremhæve de forskellige aspekter af RNA-chromatin interaktioner. Ligesom Chip-seq, er ikke alle bindende begivenheder nødvendigvis funktionelle, og kræver yderligere undersøgelser at fastslå de biologiske konsekvenser af RNA occupancy på kromatin. Ikke desto mindre forventer vi mange interessante anvendelser af denne teknologi for forskere fra andre kromatin-associerede lncRNAs, som nu nummer i tusindvis ^8,9. Ligesom Chip-seq har åbnet døren for genom-dækkende undersøgelser af DNA-protein interaktioner, kan Chirp-seq undersøgelser af "RNA Interactome" afsløre mange nye veje i biologi.

Materials

Buffer List:

Dissolve a pellet of complete protease inhibitor in 1 ml water as 50x stock. Make 100 mM PMSF in isopropanol (100x stock). Superase-in is used as 200x stock. Store all at -20°C.

Lysis Buffer:

50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use except when washing beads

Proteinase K Buffer (for DNA)

100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 8.0 (For RNA use pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% SDS
Add 5% by volume Proteainse K (Ambion AM2546 20 mg/ml) fresh before use

Hybridization Buffer

750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4°C)
Always add PMSF, P.I. and Superase-in fresh before use

Wash Buffer

2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
Always add PMSF fresh before use

DNA elution Buffer

50 mM NaHCO3
1% SDS

Table of specific reagents and equipment:

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma Aldrich	G5882-10x10ml
Motorized pellet mixer	VWR	V8185-904
Protease inhibitor	Roche	11873580001
PMSF	Sigma Aldrich	78830
Superase-in	Ambion	AM2696
Bioruptor	Diagenode	UCD-200
Falcon tubes (for sonication)	Corning	430790
Proteinase K	Ambion	AM2546
PCR purification kit	Qiagen	28106
C-1 magnetic beads	Invitrogen	65002
PMSF	Sigma Aldrich	P7626-25G
DynaMag-15 magnet	Invitrogen	123-01D
DynaMag-2 magnet	Invitrogen	123-21D
MIRNeasy mini kit	Qiagen	217004
Rnase H	Epicentre	R0601K
Rnase A	Sigma Aldrich	R4875-100MG
Phase Lock Gel Heavy	5 PRIME	2302810
Trizol	Invitrogen	15596-018
Phenol:chloroform:Isoamyl	Invitrogen	15593-031
Chloroform	Ricca	RSOC0020-1C
GlycoBlue	Ambion	AM9515
Glycine	J.T. Baker	4057-06
PBS, pH 7.4	Invitrogen	10010-049
Elution Buffer (EB)	Qiagen	19086
20x SSC	Invitrogen	15557-036
10% SDS	Invitrogen	15553-027
DNA-free	Ambion	AM1906
Buffer kit	Ambion	AM9010
Formamide	Invitrogen	15515-026